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在帕金森病研究中，RFC1 基因内含子五核苷酸重复扩增与多种疾病相关，但基因型 - 表型关联及机制不明。浙江大学医学院附属第二医院等研究人员筛查 1445 例帕金森患者 RFC1 重复扩增。发现 2 例患者有复杂双等位基因重复扩增，为研究提供新方向。
在神经退行性疾病的研究领域，帕金森病（Parkinson’s disease，PD）一直是备受关注的焦点。随着研究的不断深入，人们发现一些基因的异常与帕金森病的发生发展密切相关。其中，RFC1 基因内含子的五核苷酸重复扩增逐渐进入研究者的视野。自 2019 年，RFC1 基因中（AAGGG）
exp被确定为小脑性共济失调、神经病和前庭反射消失综合征（CANVAS）以及迟发性共济失调的遗传病因后，越来越多的研究表明，RFC1 相关疾病谱在不断扩大，涵盖了特发性感觉神经病、Charcot - Marie - Tooth 病、多系统萎缩（MSA），甚至包括帕金森病。然而，RFC1 基因重复扩增与疾病表型之间的关联却如同迷雾一般，让研究者们难以看清。不同人群中 RFC1 重复扩增的情况差异较大，其在东方人群中的患病率和临床意义尚不明确，而且相关疾病的致病机制也不清楚。为了拨开这重重迷雾，探索 RFC1 基因重复扩增与帕金森病之间的奥秘，浙江大学医学院附属第二医院等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。
研究人员从 2012 年 1 月至 2022 年 12 月，在浙江大学医学院附属第二医院神经内科，招募了 1008 例散发性帕金森病患者、281 例家族性帕金森病先证者，同时纳入 60 例进行性核上性麻痹患者、71 例多系统萎缩患者和 25 例皮质基底节变性患者。
研究人员运用了多种技术方法来深入探究。首先，采用侧翼聚合酶链反应（PCR）结合桑格测序，以及重复引物 PCR（RP - PCR），初步筛选 RFC1 基因五核苷酸重复扩增情况。之后，对确定存在重复扩增的患者样本，利用长读纳米孔测序技术，进一步明确 RFC1 基因重复位点的详细基因型。同时，收集患者皮肤成纤维细胞，运用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测 RFC1 蛋白的表达水平。此外，构建过表达不同五核苷酸重复序列的质粒并转染 HEK293T 细胞，通过 RNA 荧光原位杂交技术，检测 RNA 聚集情况。
研究结果如下：
- RFC1 五核苷酸重复扩增筛查及临床发现：通过侧翼 PCR 加桑格测序和 RP - PCR 两步法，研究人员发现 2 例早发性帕金森病患者携带 RFC1 基因双等位基因重复扩增，分别为（AAGGG）exp/（AGGGG）exp（患者 1）和（AAGGG）exp/（AAGGG）exp（患者 2）。对患者进行全面的临床评估后发现，这 2 例患者均无帕金森病、共济失调或其他神经退行性疾病家族史，对多巴胺替代疗法反应良好，但在皮肤活检免疫荧光检测中，未发现磷酸化 α - 突触核蛋白（p - α - syn）在真皮神经纤维中的沉积，这表明他们可能有着与散发性帕金森病患者不同的病理机制。另外，研究人员还发现 4 例帕金森病患者携带 RFC1 基因杂合（AAGGG）exp，但在这些患者中未检测到 RFC1 编码区罕见的点突变或插入缺失突变，并且在进行性核上性麻痹、多系统萎缩或皮质基底节变性患者中，均未检测到 RFC1 致病性扩增。
- RFC1 相关帕金森病患者 RFC1 重复扩增基因分型：利用长读测序技术，研究人员发现患者 1 携带一个（AGGGG）exp（AAGGG）14重复的等位基因和一个（AAGGG）exp重复的等位基因，同时在（AAGGG）exp序列中还检测到两个含有（AATGG）exp插入的子读段，提示存在体细胞变异。患者 2 则携带两个（AAGGG）exp重复的等位基因，且在两个等位基因中都检测到了由体细胞变异导致的含有（AATGG）exp插入的子读段。
- 过表达（AAGGG）、（ACAGG）和（AGGGG）重复序列细胞中的 RNA 聚集体：在过表达（AAGGG）、（ACAGG）和（AGGGG）重复序列的 HEK293T 细胞中，均检测到了 RNA 聚集形成的 RNA 焦点（RNA foci），而（AAAAG）和（AAAGG）重复序列在该细胞模型中未形成 RNA 聚集体。这表明 RNA 功能获得可能参与了 RFC1 相关疾病的发病过程，同时（AGGGG）exp可能是一种新的致病重复基序。
- 患者成纤维细胞中 RFC1 的表达：蛋白质免疫印迹法检测结果显示，与健康对照组相比，RFC1 相关帕金森病患者成纤维细胞中 RFC1 蛋白表达水平并未发生改变。这一结果提示，RFC1 基因重复扩增导致帕金森病表型的机制可能并非通过降低 RFC1 蛋白表达来实现。
在讨论部分，研究人员指出，RFC1 重复扩增在不同人群中的研究存在差异。在西方人群中，其与多种疾病的关联研究较为深入，但在东方人群中，相关研究较少，RFC1 重复扩增与多系统萎缩的相关性还需进一步探究。目前发现的 RFC1 相关帕金森病患者对多巴胺能药物治疗反应良好，部分患者接受脑深部电刺激（DBS）疗法也有效果。研究中观察到的复杂基因型，如（AGGGG）exp（AAGGG）和（AAGGG）exp（AATGG）exp（AAGGG）exp，表明 RFC1 相关疾病的致病机制比之前认为的更为复杂。虽然目前已知基因功能丧失、RNA 功能获得和重复相关非 AUG（RAN）翻译是内含子重复扩增的主要致病机制，但在 RFC1 重复扩增中，基因功能丧失是否参与致病过程仍不明确。而 RNA 功能获得在 RFC1 重复扩增致病机制中的作用得到了一定支持，如（AGGGG）RNA 焦点和（ACAGG）exp - RNA 焦点的检测。研究还提出了关于新发现的 RFC1 重复扩增相关致病机制的假设，例如（AATGG）exp可能促进相关五肽重复蛋白的翻译，进而产生毒性；（AGGGG）exp和（AATGG）exp - RNA 焦点可能隔离特定的 RNA 结合蛋白，导致不同的疾病表型。这些假设都有待进一步研究验证。
综上所述，该研究首次报道了 2 例 RFC1 相关帕金森病患者，并揭示了其详细的基因型。研究中发现的新重复基序和复杂基因型，为深入理解 RFC1 相关疾病的致病机制提供了新的线索，也为未来在其他 RFC1 相关疾病中开展长读测序研究以及进一步的功能研究指明了方向，对推动帕金森病及相关神经退行性疾病的研究具有重要意义。
