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在哺乳动物卵巢中，卵母细胞与颗粒细胞间的信号交流对卵泡发育至关重要，其中 c-KIT 和 GDF9 的胞内运输机制不明。研究人员围绕卵母细胞中 Exoc1 开展研究，发现其缺失会破坏 c-KIT 和 GDF9 定位，导致雌性不育。这为探究卵泡发育机制提供了新视角。
在哺乳动物的奇妙生殖世界里，雌性的生育能力就像一台精密的仪器，任何一个小部件出问题都可能导致整个生育过程受阻。卵巢中的卵泡，作为孕育生命的 “摇篮”，由卵母细胞和周围的颗粒细胞组成。卵母细胞在卵巢中要经历漫长的休眠期，从出生到性成熟，再到绝经前的重新唤醒和成熟，每一步都离不开与颗粒细胞的紧密配合。它们之间通过信号交流来协调生长、发育等重要过程，其中 c-KIT 和生长分化因子 9（GDF9）扮演着关键角色。然而，尽管科学家们已经对 c-KIT 和 GDF9 下游的信号通路有了较为深入的了解，但它们在卵母细胞内是如何运输的，这一关键问题却一直迷雾重重。
为了揭开这层神秘的面纱，来自日本筑波大学等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们把目光聚焦在了外泌体复合物（exocyst complex）的一个关键成员 ——Exoc1 上。研究发现，Exoc1 在卵母细胞中对 c-KIT 和 GDF9 的正确胞内运输起着不可或缺的作用。一旦卵母细胞中缺失 Exoc1，就如同道路的交通指挥系统失灵，c-KIT 和 GDF9 会异常滞留在细胞质中，无法到达正确的位置发挥功能。这一系列的变化会导致卵泡生长异常，卵母细胞无法正常重新唤醒，最终使雌性小鼠完全丧失生育能力。这项研究成果发表在《Cell Death Discovery》上，为我们理解卵泡发育的分子机制提供了重要线索，也为治疗雌性不育相关疾病带来了新的希望。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建基因工程小鼠模型，如通过特定的基因编辑技术构建卵母细胞特异性 Exoc1 条件性敲除（Exoc1-G-cKO）小鼠、Gdf9-Cre 敲入小鼠等；二是组织染色技术，包括苏木精 - 伊红（H&E）染色用于观察卵泡形态，免疫荧光染色用于检测蛋白定位；三是卵巢移植实验，将 Exoc1-G-cKO 小鼠的卵巢移植到受体小鼠体内，观察卵泡的生长情况。
研究结果
- Exoc1 在小鼠卵母细胞中表达：研究人员起初尝试检测野生型小鼠体内的内源性 EXOC1，但未成功。随后利用 Exoc1+/LacZ 小鼠，通过 X-gal 染色确认了 Exoc1 在卵母细胞中的表达。同时，借助公共 RNA-seq 数据也证实了外泌体复合物基因在卵母细胞中的表达，且 Exoc1 在各发育阶段的卵母细胞中表达量最高。
- 卵母细胞特异性 Exoc1 敲除小鼠卵泡生长受阻：构建 Exoc1-G-cKO 小鼠后发现，与对照组相比，8 周龄的 Exoc1-G-cKO 小鼠卵巢中没有次级和窦状卵泡，10 周龄及以上小鼠初级卵泡数量减少。进一步构建 Exoc3-G-cKO 和 Exoc7-G-cKO 小鼠，结果表明外泌体蛋白复合物对小鼠卵泡发生十分重要。将 Exoc1-G-cKO 小鼠卵巢移植到受体小鼠体内，发现 EXOC1 缺失会导致卵泡生长缺陷，但早期原始卵泡池的耗尽并非直接由卵母细胞中 EXOC1 的缺乏引起。
- Exoc1 敲除影响卵母细胞重新唤醒和 c-KIT 定位：测量 10 周龄 Exoc1-G-cKO 小鼠卵母细胞直径发现，初级卵泡中的卵母细胞直径明显小于对照组，这意味着卵母细胞重新唤醒过程受阻。对 c-KIT 定位的研究发现，在 Exoc1-G-cKO 小鼠初级卵泡的卵母细胞中，c-KIT 信号异常聚集在细胞质中，而对照组主要位于细胞膜上。
- 人工激活 PI3K-Akt 通路可挽救 Exoc1 敲除导致的卵母细胞重新唤醒失败：研究人员推测 Exoc1-G-cKO 小鼠卵母细胞重新唤醒失败与 c-KIT 功能障碍有关。通过注射 PTEN 抑制剂 bisperoxovanadium（bpV）进行挽救实验，结果显示，bpV 处理后的 Exoc1-G-cKO 小鼠初级卵泡中的卵母细胞明显增大，部分甚至与对照组次级卵泡中的卵母细胞大小相当，这表明卵母细胞重新唤醒失败是由 c-KIT 及其下游信号通路受损引起的。
- Exoc1 敲除影响 GDF9 分泌：在 bpV 处理的 Exoc1-G-cKO 小鼠中，虽然卵母细胞大小增加，但颗粒细胞并未多层化，研究人员猜测这可能是由于促进颗粒细胞增殖的卵母细胞分泌因子受到干扰。通过对 GDF9 定位的研究发现，EXOC1 缺失会干扰 GDF9 从卵母细胞向颗粒细胞的分泌。
- c-KIT 和 GDF9 定位异常影响下游通路：Exoc1 缺失导致 c-KIT 和 GDF9 定位异常，进而影响它们的下游通路。FOXO3a 免疫染色显示，Exoc1 敲除部分破坏了 c-KIT 诱导的原始卵泡激活通路；PCNA 免疫荧光显示，Exoc1-D-cKO 小鼠初级卵泡中 PCNA 阳性的颗粒细胞数量明显减少，表明 GDF9 分泌的下游通路存在缺陷。
- 出生前 Exoc1 缺失影响囊肿破裂和卵泡发生：为研究出生前 Exoc1 缺失对囊肿破裂的影响，研究人员构建了 Exoc1-D-cKO-E 小鼠模型。结果发现，Exoc1-D-cKO-E 小鼠在出生后 0 天（P0）时，卵母细胞质膜上的 c-KIT 信号明显低于对照组；在 P5 时，卵巢中仍存在囊肿，且成年后卵巢大小、卵泡数量和卵母细胞直径均显著降低，这表明 Exoc1 在胎儿发育期间对囊肿破裂和卵泡发生至关重要。
研究结论与讨论
这项研究明确了小鼠卵母细胞中的 Exoc1 对 c-KIT 和 GDF9 的胞内运输至关重要，而这两种因子是卵母细胞与颗粒细胞之间信号交流的关键分子。Exoc1 的缺失会导致卵泡发育异常，最终引发雌性不育。虽然研究揭示了 Exoc1 在这一过程中的重要作用，但仍有许多问题有待进一步探索。例如，目前尚未明确与 c-KIT 内体运输相关的囊泡类型，也不清楚 Exoc1 与 GDF9 分泌之间具体的关联机制。此外，Exoc1 在不同卵泡发育阶段以及不同类型卵泡中的作用还需要更深入的研究。尽管如此，这项研究为后续探究卵泡发生的分子机制奠定了坚实的基础，有助于推动生殖医学领域的发展，为解决雌性不育问题提供新的思路和方向。
