CALBIA 法：突破人类染色体 DNA 克隆难题，助力基因组研究新飞跃

在人类基因组研究中，构建数百万碱基对的功能基因簇困难重重。研究人员开展了关于构建 Mb 级人类 DNA 方法的研究，开发出 CALBIA 法，成功组装 2.1-Mb 人类染色体 DNA，提高遗传稳定性，为复杂超大 DNA 组装提供了有力工具。

　　在人类基因组研究的征程中，尽管人类基因组计划取得了显著进展，但想要深入理解和操控人类基因组，实现各种实际应用，仍然面临着诸多挑战。其中，快速组装和构建跨越数百万碱基对（Mb）的功能基因簇，就像是一座横亘在科学家面前的巍峨高山，成为了关键的技术障碍。

DNA 组装技术在构建大型 DNA 分子方面发挥着重要作用，在体外它能够构建出大小达几百千碱基（kb）的 DNA 分子。然而，当 DNA 片段达到 Mb 级别时，情况就变得复杂起来。由于受到剪切力的影响，这些大片段 DNA 在体外很容易发生断裂，所以往往需要在体内进行组装。目前，体内组装大型 DNA 的主要方法依赖于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源重组系统。例如，He 等人就利用酵母生命周期组装法，在酵母细胞内成功组装出了 1.26-Mb 的人类免疫球蛋白基因簇。不过，大肠杆菌（E. coli）其实也是大型 DNA 组装和染色体工程的理想宿主。这是因为大肠杆菌的天然同源重组活性较低，能够增强长达 300 kb 的人类 DNA 片段的遗传稳定性。因此，开发基于大肠杆菌的组装技术，对于快速组装人类和其他高等生物的复杂基因组至关重要。此前，Zurcher 等人虽然开发了一种利用圆形载体在大肠杆菌细胞中迭代组装 1.1-Mb 人类 DNA 的方法，但测序结果显示，当 DNA 大小接近 Mb 级别时，正确且完全组装的克隆比例下降到了 10% 以下。

为了攻克这些难题，中国科学院分子植物科学卓越创新中心合成生物学重点实验室以及上海交通大学生命科学与生物技术学院微生物代谢国家重点实验室的研究人员展开了深入研究。他们开发出了一种名为共轭相关线性细菌人工染色体迭代组装（Conjugation - Associated Linear - Bacterial Artificial Chromosome Iterative Assembling，CALBIA）的方法，成功实现了 Mb 级人类 DNA 的高效组装，并将研究成果发表在了《Cell Research》上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，他们利用原核端粒系统 TelN - tos 构建了线性细菌人工染色体（BAC）质粒作为大型 DNA 组装的载体。通过单交叉同源重组，使线性 BAC 质粒的单链 DNA 形式与受体 BAC 质粒的同源片段进行重组，从而完成 DNA 片段的组装。其次，脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术被用于基于 DNA 大小对组装的线性 DNA 片段进行分离和验证。此外，研究人员还构建了线性化的大肠杆菌染色体作为组装载体，通过将含有 Mb 级人类 DNA 的游离 BAC 质粒整合到线性染色体中，提高了异源超大 DNA 的遗传稳定性。

研究结果如下：

1. CALBIA 法的可行性验证：研究人员通过构建线性 BAC 质粒作为载体，利用单交叉同源重组，成功组装了三个 Mb 级别的人类染色体 DNA 片段。这一成果表明 CALBIA 法在组装大型 DNA 方面具有可行性。
2. IgHV 基因簇的组装：免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因簇对于人类抗体的特异性和多样性至关重要，其跨越兆碱基级别且包含近百个重复单元。研究人员运用 CALBIA 法连续组装了七个 BAC 质粒，每个质粒包含 150 - 200 kb 的 IgHV 基因簇，最终成功在 pG 中组装出了完整的 IgHV 基因簇，总大小达 1.07 Mb。
3. 遗传稳定性研究：随着组装 DNA 接近 1 Mb，PFGE 中可检测到的 DNA 条带逐渐减少，这表明存在遗传不稳定的问题。为了解决这一问题，研究人员构建了线性化的大肠杆菌染色体作为组装载体。实验结果显示，将含有 Mb 级人类 DNA 的质粒整合到大肠杆菌的线性染色体中，能够显著提高其遗传稳定性。例如，整合到染色体中的 pG（含有 1.07 Mb 人类 DNA）和 pZR11（含有 1.18 Mb 人类 DNA）在大肠杆菌中的遗传稳定性明显高于游离在染色体外的情况。
4. 更大片段 DNA 的组装：研究人员以已经组装了 845 kb 人类 DNA 的 BAC 质粒 pZR5 为基础，通过连续的 CALBIA 组装，将其整合到线性染色体的 EMT21 中，经过五轮组装，成功在大肠杆菌中合成了大于 2 Mb 的人类 DNA。最终得到的大肠杆菌菌株 HMT18，其染色体大小为 6.09 Mb，包含 2.13 Mb 的人类 DNA 和 3.96 Mb 的大肠杆菌 DNA。通过多次 PCR 和 PFGE 验证，组装的准确率在 67% - 100% 之间，并且随着组装 DNA 大小的增加，效率并未下降。
5. 全基因组测序验证：研究人员对四个 Mb 级别的 DNA（pG：1.1 Mb；pZR6：1.1 Mb；pZR11：1.2 Mb；HMT18：2.1 Mb）进行了全基因组测序，进一步验证了其完整性。虽然在部分样本中发现了一些变异，但经过分析，部分变异是由聚合酶滑动引起的，在富含 AT 的区域较为常见，不属于组装错误。最终计算出的组装效率分别为：pG 为 10%，pZR6 为 90%，pZR11 为 70%，HMT18 为 61.5%。

研究结论和讨论部分指出，CALBIA 法在组装大小（2.13 Mb）和人类基因组 DNA 的遗传稳定性（长达 3 天）方面具有明显优势。与之前报道的方法相比，CALBIA 法无需引入 Cas9 系统或 Lambda Red 同源重组系统，避免了 Cas9 切割后小重复序列错误重组的风险，尤其适用于组装含有重复序列的人类基因组 DNA。此外，利用构建的线性大肠杆菌染色体作为载体，很大程度上解决了人类 DNA 组装中的遗传稳定性问题，使得在细菌中组装和稳定遗传超过 2 Mb 的人类超大 DNA 片段成为可能。这一研究成果为复杂超大 DNA 的组装提供了一种有价值的技术手段，有助于快速高效地进行基因组组装，为高等真核生物的功能基因组研究和应用开辟了新的道路，在生命科学和医学领域具有重要的意义。