信号肽酶SpsB调控金黄色葡萄球菌细胞周期、表面蛋白隔膜运输及脂磷壁酸合成的分子机制

这篇研究揭示了金黄色葡萄球菌中信号肽酶SpsB通过双重机制调控YSIRK+表面蛋白（如SpA）的隔膜定向运输：一方面直接高效剪切SPYSIRK+信号肽促进蛋白在分裂隔膜的富集；另一方面通过剪切LtaS（脂磷壁酸合成酶）调控其空间活性，从而协调细胞周期、细胞壁合成与毒力因子分泌。该发现为革兰氏阳性菌蛋白质分选机制提供了新范式。

　　

ABSTRACT
革兰氏阳性菌细胞壁锚定表面蛋白（含保守YSIRK/G-S信号肽SP_YSIRK+）定位于分裂隔膜。本研究揭示金黄色葡萄球菌中信号肽酶SpsB通过双重机制调控此类蛋白的隔膜运输：其剪切活性不仅直接作用于SP_SpA(YSIRK+)，还通过调控LtaS的空间分布影响脂磷壁酸合成。

RESULTS
SpsB缺失导致SpA隔膜定位消失
通过构建诱导型spsB缺失株（SEJ1ispsB）和SpA截短变体（SpA*），研究发现：

1. 免疫印迹显示spsB缺失时，SP_SpA前体在细胞质和膜组分中积累（红色箭头标记未剪切条带）
2. 免疫荧光显示：正常条件下SpA*定位于隔膜（荧光比率FR=3.5），而spsB缺失后呈外周分散分布（FR≈1.1）
3. 点突变A37P破坏SpsB剪切位点（AXA₃₆）后，SpA*同样丧失隔膜定位

细胞周期与细胞壁合成异常
spsB缺失株呈现多重表型缺陷：

• 细胞分裂阻滞：30%细胞停滞在完全隔膜形成阶段（P3）
• 荧光D-氨基酸（FDAA）标记显示异常：35%细胞出现非极性壁合成（HADA/RADA/OGDA呈点状分布）
• 透射电镜显示多隔膜结构和子细胞分离障碍

SpsB的隔膜富集特性
mCherry/SfGFP双标记实验证实：

• 全长SpsB主要定位于分裂隔膜（FR=2.8）
• 跨膜域缺失突变体（SpsB_Δ2-27）丧失膜定位能力
• 分子动力学模拟显示其跨膜域与革兰氏阳性菌膜（PG:lysl-PG:cardiolipin=60:35:5）的稳定结合

LtaS的空间调控新机制
通过构建GFP-LtaS_WT/_S218P融合蛋白发现：

1. 抗剪切突变体LtaS_S218P持续富集于隔膜
2. spsB缺失时，野生型LtaS在隔膜积累（荧光强度提升2.1倍）
3. 免疫印迹显示spsB缺失导致全长LtaS（74.4kDa）增加，eLtaS（49.3kDa）减少

DISCUSSION
研究提出"双机制模型"：

1. 效率机制：高表达的YSIRK+前体被隔膜富集的SpsB高效剪切（较YSIRK-信号肽快3倍）
2. 空间机制：SpsB通过剪切LtaS限制其在隔膜的活性，形成LTA合成梯度（隔膜低/外周高）
   该发现为理解革兰氏阳性菌中蛋白质分泌-细胞周期-细胞壁合成的协同调控提供新视角，其保守性暗示该机制可能适用于链球菌等病原体。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：

• 条件性基因敲除（pKOR1系统）
• 时序FDAA标记（20分钟/轮）
• 双荧光标记定位（Van-FL/Nile red共染色）
• 亚细胞分级（膜/壁/胞质分离效率>90%）
  统计采用GraphPad Prism进行Welch校正t检验（*P<0.05为显著）。