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在斑马鱼研究中，亚甲蓝（MB）使用浓度缺乏统一标准且其对早期斑马鱼代谢影响未知。研究人员开展了 MB 推荐浓度对发育中斑马鱼（1 - 5 天胚胎期（dpf））代谢影响的研究。结果显示 MB 会改变斑马鱼氧化代谢，还可能干扰实验。该研究为斑马鱼研究中 MB 的使用提供重要参考。
在生命科学的研究舞台上，斑马鱼作为一种明星实验动物，凭借其易饲养、繁殖力强、胚胎透明发育迅速以及遗传易操作等诸多优势，广泛活跃于发育生物学、遗传学、毒理学等多个领域。特别是在早期生命阶段，斑马鱼胚胎无需遵循脊椎动物实验伦理法规，这使其成为高通量药物筛选和毒性测试的热门选择。
然而，在斑马鱼的饲养过程中，一个问题悄然浮现。亚甲蓝（Methylene Blue，MB）作为一种常用的抗真菌剂，被广泛应用于斑马鱼胚胎的培养。但尴尬的是，不同科学组织对 MB 的使用浓度推荐各不相同。加拿大动物护理委员会（CCAC）推荐在 E3 培养基中使用 0.00005% 的 MB，美国冷泉港实验室（CSH）协议则建议使用 0.0001% 的浓度，而经济合作与发展组织（OECD）的鱼类急性胚胎毒性测试指南等却对其只字未提。这种混乱的局面导致斑马鱼研究中 MB 的使用和报告乱象丛生。
更关键的是，虽然 MB 的代谢作用早在近百年前就有报道，它能影响肿瘤组织、红细胞等的氧消耗，还被用于治疗高铁血红蛋白血症、氰化物中毒等，甚至在衰老和神经退行性疾病治疗方面也有研究。但在斑马鱼研究领域，目前推荐浓度的 MB 对早期斑马鱼代谢有何影响，是否会干扰实验结果，这些问题一直迷雾重重。为了拨开这层迷雾，来自加拿大渥太华大学（University of Ottawa）和加拿大卫生部（Health Canada）的研究人员 Niepukolie Nipu、Lai Wei 等人展开了深入研究，相关成果发表在《Communications Biology》杂志上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过斑马鱼适应的代谢检测技术，如 Seahorse 检测和 Alamar Blue 检测，在生物个体水平检测代谢变化；利用靶向代谢基因表达分析，在分子水平探究基因表达的改变；采用 JC - 10 线粒体膜电位检测，评估线粒体膜电位（ΔΨm）变化；借助转录本丰度检测，分析基因表达量的差异；通过幼虫应激反应和皮质醇定量实验，研究内分泌应激轴的变化情况。
研究结果如下：
- 亚甲蓝对 1 - 2dpf 斑马鱼的影响：用改良的 Seahorse 检测评估发育过程中暴露于推荐浓度 MB 的斑马鱼胚胎发现，0.00005%（CCAC 推荐）和 0.0001%（CSH 推荐）的 MB 均显著增加 1dpf 斑马鱼胚胎的基础氧消耗率（OCR）。CCAC 推荐浓度的 MB 使 ATP 生成增加，CSH 推荐浓度的 MB 则使备用呼吸能力显著降低。同时，在对照组幼虫中存在的基础与最大 OCR 之间的显著正相关关系，在 MB 暴露的胚胎中消失。2dpf 斑马鱼胚胎暴露于不同浓度 MB 后，幼虫表层 ΔΨm显著增加。
- 亚甲蓝对孵化后斑马鱼的影响：采用 Alamar Blue 检测斑马鱼不同发育阶段的能量消耗，发现暴露于最高测试浓度 0.001% 的 MB 后，斑马鱼基于氧化代谢的能量消耗显著降低。在标准饲养条件下，长期暴露于推荐及更高浓度 MB 的斑马鱼，其氧化代谢相关能量消耗持续下降。即使是 3 - 4dpf 短期急性暴露于 MB，斑马鱼在 4dpf 时氧化代谢相关能量消耗也显著降低。
- 亚甲蓝对线粒体呼吸复合物基因表达的影响：对 1 和 4dpf 暴露于 0.00005% MB 的斑马鱼进行检测，发现 1dpf 时，线粒体呼吸复合物转录本 sdhda、sdhdb 和 cox4i1 的相对丰度显著降低；4dpf 时，ndufa9a、sdhdb、uqcre2a 和 atp5fle 的转录本相对丰度显著下降。
- 亚甲蓝对斑马鱼孵化时间和应激轴的影响：CSH 推荐浓度 0.0001% 的 MB 使斑马鱼胚胎在 2dpf 时提前孵化。虽然检测到与内分泌应激轴功能相关基因转录本丰度下降，但发育过程中暴露于 MB 并未影响 5dpf 斑马鱼幼虫在应激后的皮质醇反应。
研究结论和讨论部分指出，斑马鱼胚胎发育过程中暴露于推荐浓度的 MB，会引起机体代谢的显著变化，这与 MB 在其他模型中的作用模式一致。MB 可能通过影响线粒体功能，干扰氧化代谢。同时，MB 作为一种氧化还原试剂，还可能干扰广泛应用的斑马鱼代谢表型检测方法 Alamar Blue 检测。鉴于斑马鱼在生物医学研究和毒性评估中的重要地位，研究人员应重新审视 MB 在斑马鱼研究中的使用，避免其对实验结果产生干扰。这一研究为斑马鱼研究中 MB 的合理使用敲响了警钟，也为后续相关研究提供了重要的参考依据，有助于规范斑马鱼实验操作，推动生命科学和健康医学领域研究的准确性和可靠性。
