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为解决 DEAD-box 解旋酶在双链解旋时主动打开碱基对数及寡聚体协调机制不明的问题，研究人员以 Ded1p 为对象，运用高分辨率光镊和荧光技术开展研究。结果发现其解旋是动态随机过程，以 4 - 6bp 步长进行。该研究为理解相关酶机制提供依据。
在微观的生命世界里，RNA 就像一位忙碌的信息传递者，参与着生命活动的各个环节。而 RNA 解旋酶则如同 RNA 的 “得力助手”，帮助其解开复杂的双链结构，以便顺利完成各种使命。其中，DEAD - box RNA 依赖的 ATP 酶（DEAD - box RNA - dependent ATPases）在所有生命领域都普遍存在，它能与 RNA 及 RNA - 蛋白质复合物结合并重塑它们的结构。像酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的 Ded1p 这种具有解旋酶活性的 DEAD - box ATP 酶，可通过局部打开螺旋区域来解开 RNA 双链，且部分酶会寡聚化以更有效地完成解旋工作。
然而，长期以来，科学界对 DEAD - box 解旋酶的一些关键机制却知之甚少。比如，在解开双链的过程中，它们究竟能主动打开多少碱基对？这一数字可是衡量解旋酶活性的关键指标，直接关系到解旋效率。另外，寡聚化的 DEAD - box 解旋酶如何协调寡聚化、底物结合、解旋以及 ATP 水解循环等过程，也一直是未解之谜。尽管科研人员对 Ded1p、其人类同源物 DDX3X 以及 DEAD - box 解旋酶的机制研究已持续了三十多年，包括近期开展的单分子研究，但这些基本机制问题依旧悬而未决。
为了攻克这些难题，来自美国密歇根州立大学（Michigan State University）和凯斯西储大学（Case Western University）等机构的研究人员展开了深入探索。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解 DEAD - box 解旋酶的工作机制带来了新的曙光。
研究人员运用了两种关键技术来开展研究：高分辨率光镊（optical tweezers）和单分子荧光技术（single molecule fluorescence，即 fleezers，光镊与荧光结合技术 ）。利用高分辨率光镊，他们能够在单分子水平上精确测量 Ded1p 对 RNA 双链的解旋过程；而单分子荧光技术则帮助他们观察 Ded1p 与 RNA 的结合情况。
Ded1p 以多步可逆方式解开双链 RNA
研究人员使用高分辨率光镊，对 Ded1p 解开典型 RNA 底物的过程进行单分子水平的研究。他们设计了一种特殊的 RNA 底物，是一个带有 16bp 发夹结构且 3' 端有 25nt 突出的 RNA，连接在一对约 1.5kb 的双链 DNA（dsDNA）之间。实验时，将这个底物固定在两个被光阱捕获的微球之间进行监测。
在不同 Ded1p 浓度下进行实验，结果发现：低浓度（100nM）时，RNA 发夹会反复部分解旋，通常只有一个约 5 - 6bp 的解旋步骤，随后迅速重新螺旋化；高浓度（500nM）时，RNA 发夹能快速、可逆且频繁地完全解旋，会出现两个连续约 5 - 6bp 的解旋步骤，接着是较小的约 2 - 3bp 的步骤。通过进一步实验，他们发现这种反复的解旋和重新螺旋化反应需要 Ded1p 蛋白不断地结合和脱离 RNA 底物。
研究人员还构建了详细的状态模型来描述 RNA 解旋的逐步过程。解旋步骤大小分布显示，较大的 5 - 6bp 解旋步骤多发生在反应初期，较小的 2 - 3bp 步骤多在解旋接近完成时出现；重新螺旋化步骤大小分布范围则覆盖了 RNA 发夹的全长。解旋状态呈现出明显的进展过程，从完全螺旋的状态（0bp）开始，依次经过部分解旋的状态（约 5.5bp、12bp），最终达到完全解旋（16bp）。但最后一个阶段的解旋步骤与前两个不同，可能是 Ded1p 和 RNA 发夹复合物的某种松弛过程。
动力学分析表明单个 Ded1p 单体依次结合导致逐步解旋
为了探究 Ded1p 与 RNA 双链结合和解旋活性之间的关系，研究人员在不同 Ded1p 浓度下进行光镊测量和解旋状态分析。他们发现，随着 Ded1p 浓度从 100nM 增加到 500nM，前两个解旋步骤（0→1 和 1→2）的速率常数增大，这表明单个 Ded1p 单体随着解旋步骤依次结合到 RNA 上；而所有重新螺旋化步骤的速率常数则随着 Ded1p 浓度的增加而减小，说明额外的 Ded1p 单体结合会抑制重新螺旋化。最后一个看似解旋的步骤（2→3），其速率常数变化趋势与前两个解旋步骤相反，更符合单体解离的特征。
研究人员还研究了 ATP 在 RNA 逐步解旋中的作用。结果发现，增加 ATP 浓度会使前两个解旋步骤的速率常数增大，而重新螺旋化步骤的速率常数略有减小。这是因为 ATP 水解先于 Ded1p 单体从 RNA 发夹上解离，溶液中的 ATP 可能与仍结合在 RNA 上的 Ded1p - ADP 交换，从而重新稳定解旋酶与 RNA 的结合。使用缓慢水解的 ATP 类似物 AMPPNP 进行实验时，也观察到多步解旋，但重新螺旋化步骤受到强烈抑制。
综合这些动力学结果，研究人员认为两个带有结合 ATP 的 Ded1p 单体依次结合并解开 RNA 发夹，而看似最后一个小的解旋步骤（2→3）实际上可能是 Ded1p 单体解离导致的 RNA 部分松弛。之前的整体实验表明三个 Ded1p 蛋白对于高效完全解旋是必要的，且相邻的 3' 单链 RNA（ssRNA）尾巴很关键。因此，研究人员推测第三个蛋白结合在尾巴上，并通过荧光和光镊结合实验进行了验证。
荧光技术揭示单个 Ded1p 结合到 RNA 尾巴促进解旋
由于 Ded1p 结合到 RNA 发夹会导致光镊信号可检测的变化，但结合到相邻的 3'ssRNA 尾巴时光镊信号难以检测。为此，研究人员设计了一种基于蛋白质诱导荧光增强（PIFE）方法的单分子荧光检测实验，并与光镊解旋测量同时进行。他们在 3' 尾巴中间的一个碱基上连接了 Cy3 荧光团，期望当 Ded1p 蛋白结合到附近时能观察到 Cy3 荧光强度增加。
实验结果显示，在含有 Ded1p（500nM）和 ATP（2.5mM）的缓冲液中，光镊测量到 RNA 发夹反复解旋和重新螺旋化，同时荧光测量显示荧光信号增强的区间与 RNA 发夹解旋活动的区间高度相关。通过对荧光数据的分析发现，在 RNA 发夹完全螺旋（状态 0）时，低荧光状态（即没有 Ded1p 结合到尾巴上）占主导；而在解旋的前两个状态（状态 1 和状态 2），大部分时间荧光是高的，即有 Ded1p 结合到尾巴上。在解旋步骤（从状态 0 到状态 1）发生时，荧光增强的概率显著增加，解旋后这一概率继续上升。
随着解旋的进行，结合有 Ded1p 的状态（高荧光）的比例逐渐下降，到状态 3 时，主要是低荧光状态，这表明 Ded1p 从尾巴上解离。状态 3 可能是一种或两种参与解旋的 Ded1p 已经解离，而最后一个结合在 RNA 发夹茎环附近的 Ded1p 仍在防止 RNA 发夹重新螺旋化的状态。
研究人员通过一系列实验，详细揭示了 Ded1p 解旋 RNA 双链的动态机制。他们发现解旋过程是高度动态和随机的，由三个 Ded1p 单体分别在 RNA 双链和相邻尾巴上结合和解离来完成。第一个 Ded1p 单体结合到双链上时，大约解开 5 - 6bp 的 RNA，这一数值虽然可能因一些因素存在低估，但仍是单个 Ded1p 解旋能力的最佳估计。多个 Ded1p 单体的组装是随机的，且受相邻单体的影响，这种组装和解聚的平衡导致了底物完全解旋活性对浓度的强烈依赖性。
这项研究对于理解 Ded1p 及其人类同源物 DDX3 在细胞中的多样化作用具有重要意义。例如，在翻译起始过程中，Ded1p 如何结合到非结构化 RNA 区域并解开下游结构化区域，研究结果提供了新的解释思路。此外，对于理解 Ded1p 在剪接 II 型内含子和相关伴侣活性中的作用，以及在相分离液滴中可能增强的寡聚化机制等方面，都提供了重要的理论基础。它为涉及 DEAD - box 解旋酶的 RNA 加工机制研究提供了新的视角，推动了生命科学领域对 RNA 代谢过程的深入理解。
