快速构建 iPSC 衍生神经肌肉接头模型：揭开肌萎缩侧索硬化细胞病变中运动神经元的主导作用

神经肌肉接头（NMJ）功能障碍会引发严重运动疾病，现有研究受限于缺乏精准人类模型。研究人员开发快速 iPSC 衍生 NMJ 模型研究肌萎缩侧索硬化（ALS），发现 SOD1G85R突变运动神经元（MNs）主导 NMJ 细胞病变，该模型为相关研究及治疗提供助力。

　　在人体中，神经肌肉接头（Neuromuscular Junction，NMJ）起着至关重要的作用，它负责将运动神经元（Motor Neuron，MN）的信号传递给骨骼肌（Skeletal Muscle，SKM），从而引发肌肉收缩，让我们能够自如地运动。然而，当 NMJ 出现功能障碍时，就会导致严重的运动疾病，比如肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）。ALS 是一种渐进性的运动功能障碍疾病，每 10 万人中约有 1 - 2 人患病，大多数患者在 3 - 5 年内就会失去运动功能并死亡。目前，针对 ALS 的治疗手段只能在一定程度上缓解疾病后期的症状，无法实现根治。

一直以来，由于缺乏精准的人类 NMJ 模型，科学家们对 NMJ 在疾病中的作用机制了解有限。现有的基于啮齿动物、细胞系和原代细胞的模型与人类 NMJ 存在显著差异。虽然人类诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）为构建准确的患者来源 NMJ 模型带来了希望，但已有的 iPSC 衍生模型存在诸多问题，如分化效率有限、生成时间长、冷冻保存困难等。为了深入探究 NMJ 的奥秘，找到治疗 ALS 等疾病的新方法，来自佛教慈济医疗基金会生物创新中心等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上。

研究人员为了构建快速且有效的人类 NMJ 模型，采用了一系列关键技术方法。他们从 iPSCs 出发，分别诱导分化出 MNs 和 SKMs，并进行冷冻保存。通过优化的分化方案，获得了高纯度的细胞。之后，将解冻后的 MNs 和 SKMs 进行共培养，在 12 天内成功构建出具有功能的 NMJ 模型。同时，利用免疫细胞化学（ICC）技术对细胞标记物进行检测，借助 3D 共聚焦显微镜成像和相关软件对 NMJ 的结构和功能进行定量分析。此外，他们使用不同的 iPSC 细胞系，包括 SOD1^G85R突变的 ALS 细胞系和对应的健康等基因细胞系，以及 SOD1^D90A突变的 ALS 细胞系和健康等基因细胞系，来研究 ALS 相关的 NMJ 细胞病变。

稳健生成即用型冷冻保存 MN 库

研究人员开发了 CHSF - MN 协议，这是一种高效的 MN 分化方法。利用该方法，iPSCs 能够高效转化为 MNs，在分化第 10 天，神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC）标记物 PAX6 和 SOX1 高表达；第 14 天，NSC 和运动神经元祖细胞（Motor Neuron Progenitor，MNP）标记物高表达；到第 28 天，大多数细胞表达 MN 特异性标记物 HB9 和神经纤维标记物 Neurofilament（NF），此时将 MN 球体冷冻保存。解冻 4 天后，细胞高表达经典神经元标记物、突触标记物和 MN 特异性标记物，经统计，90.9% ± 0.87% 的分化细胞表达 HB9，87.38% ± 2.04% 表达 ISL1，证明获得了高纯度的 MNs。

iPSCs 分化为骨骼肌成肌细胞库及进一步的 SKM 成熟

为获取高纯度的人类 SKMs，研究人员采用了一种无转基因的分化方案。经过 28 天的分化，得到骨骼肌成肌细胞，再进行 5 次传代扩增后冷冻保存。解冻后的成肌细胞在终端 SKM 成熟的第 12 天呈现出肌管样纺锤结构，免疫细胞化学分析证实其表达 SKM 特异性标记物，如 Myogenic Differentiation 1（MYOD）、Myogenin（MYOG）、Myosin Heavy Chain（MHC）和 Titin（TTN），且细胞具有典型的 SKM 特征，如多核化、横纹和 TTN 纤维带，成功实现了骨骼肌成肌细胞的分化、扩增、冷冻保存和 SKM 的成熟。

共培养 12 天内建立 NMJ 样组织

将解冻后的成肌细胞成熟为 SKMs，再将即用型 MN 球体直接接种到肌管层上，共培养 4 - 7 天。在第 9 天，MNs 投射神经纤维进入 SKM 层，观察到大量 AChR 簇表达，且在 NMJ 终板样位点 TTN、NF/SV2 和 AChR 共定位，此时有自发肌管收缩现象，但刺激后收缩无明显节律。到第 12 天，NF/SV2 和 AChR 在终板样结构上高度共定位，CaCl₂刺激成功引发显著的节律性 SKM 收缩，且收缩可被 AChR 拮抗剂抑制，表明功能性 NMJs 在 12 天内成功建立。

SOD1^G85RALS 和 SOD1^G85G等基因健康 SKMs 的特性无显著差异

研究人员从 SOD1^G85R突变的 ALS 和 SOD1^G85GCRISPR/Cas9 校正的健康等基因 iPSC 系制备 SKM 和 MN 细胞库。对分化后的 SKMs 进行检测，发现 SOD1^G85G和 SOD1^G85RSKMs 在 MYOD 表达、肌管融合指数、肌管长度和宽度等指标上无显著差异，在自发收缩和 CaCl₂刺激收缩率方面也无显著差异，说明 SOD1^G85RSKMs 不存在 ALS 细胞病变。

SOD1^G85RMNs，而非 SKMs，降低 9 天交叉共培养 NMJ 模型中 AChR 的表达

通过建立交叉共培养 NMJ 模型，研究人员对不同组合的 MNs 和 SKMs 进行研究。3D 共聚焦显微镜图像显示，与 SOD1^G85RMNs 共培养的 NMJs 中 AChR 表达显著降低，AChR/SKM 和 AChR/MN 比值下降，而 SOD1^G85G和 SOD1^G85RSKMs 对 AChR 表达无显著影响，表明 MNs 是 SOD1^G85R突变 ALS NMJ 模型中 AChR 细胞病变的主要引发者。

SOD1^G85RMNs 改变 AChR 的特性并降低 12 天 NMJ 模型中钙诱导的 SKM 收缩

在 12 天的 NMJ 模型中，SOD1^G85RMNs 与健康的 SOD1^G85GSKMs 共培养。结果显示，与 SOD1^G85GMNs 共培养的 NMJs 相比，SOD1^G85RMNs 共培养的 NMJs 中 AChR 数量减少、单个 AChR 体积减小、强度增加、总 AChR 体积降低，AChR 主要分布在 SKM 内部而非表面。功能检测发现，SOD1^G85RMNs 共培养的 NMJs 在 CaCl₂刺激后，SKM 收缩延迟且不清晰，收缩率降低，表明 SOD1 突变 MNs 显著影响 ALS 细胞病变，改变 AChR 的多个方面及 SKM 收缩功能。

SOD1^D90AMNs 降低 NMJ 中 AChR 的表达和钙诱导的 SKM 收缩

为验证模型的可重复性，研究人员使用另一对 SOD1 突变 iPSC 系（SOD1^D90AALS 和 SOD1^D90D健康等基因 iPSC 系）建立 NMJ 模型。结果显示，SOD1^D90AMNs 共培养的 NMJs 中 MN 体积减小，AChR/SKM 比值降低，对 CaCl₂刺激几乎无收缩反应，表明 SOD1^D90AMNs 显著降低 AChR 表达并损害 MN 支配的 SKM 收缩。

在讨论部分，研究人员指出，他们在模型中观察到的 AChR 变化与早期 ALS 患者肌肉活检结果相似，这表明该模型与实际患者组织具有相关性。同时，SOD1^G85R和 SOD1^D90A突变导致的细胞病变存在差异，强调了在研究 ALS 病理和开发靶向疗法时，识别特定 SOD1 突变的重要性。此外，以往的 iPSC - 基于的 NMJ 模型存在技术挑战和时间成本高的问题，而本研究建立的快速 NMJ 模型仅需 12 天，操作简便，为研究 NMJ 病理生理学和开发治疗 ALS 等神经肌肉疾病的疗法提供了有力工具。

总的来说，这项研究成功构建了快速的 iPSC 衍生 NMJ 模型，揭示了 ALS 中 MNs 在引发 NMJ 细胞病变中的主导作用，为深入理解 NMJ 相关疾病的发病机制和开发新的治疗方法提供了重要的实验依据和研究平台，具有重要的科学意义和临床应用潜力。