Induro-tRNAseq 全基因组分析 tRNA 修饰：解锁翻译调控密码，洞悉生命奥秘

在生命科学研究中，tRNA 修饰的 mapping 和量化极具挑战。研究人员开展了 Induro-tRNAseq 技术相关研究，发现其可揭示 tRNA 修饰的协调变化。这一成果对理解蛋白质稳态及 tRNA 修饰在不同组织和细胞类型中的作用意义重大。

　　在微观的生命世界里，tRNA（转运核糖核酸）如同忙碌的 “搬运工”，在蛋白质合成过程中发挥着关键作用。所有天然 tRNA 都会经历广泛的转录后修饰，这些修饰就像是给 tRNA 装上了精密的 “调节开关”，能调控基因表达。然而，要精准绘制这些修饰的 “地图” 却困难重重。其中最大的阻碍在于，常用的反向转录酶（RT）在读取 tRNA 修饰时，常常会 “卡壳”，难以顺利完成从 RNA 到 cDNA 的合成，导致现有的大多数全基因组 tRNA 测序（tRNAseq）数据集无法提供足够的 tRNA 修饰信息，这就像在探索一座神秘的城堡时，关键的地图缺失了许多重要细节。

为了攻克这一难题，来自美国托马斯杰斐逊大学（Thomas Jefferson University）等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们开发了一种名为 Induro-tRNAseq 的新技术，利用新的组 II 内含子编码的反向转录酶 Induro，对 tRNA 修饰进行全基因组分析。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解 tRNA 修饰的奥秘打开了新的大门。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。他们从培养的人类细胞或小鼠组织中提取总 RNA，通过一系列酶促反应，包括 tRNA 的去酰化、末端修复、连接条形码 3'- 适配器等操作，构建了 Induro-tRNAseq 文库。之后，利用 Induro 进行逆转录，将 tRNA 转化为 cDNA，再通过 PCR 扩增添加 Illumina 适配器，最后进行测序分析。在数据分析阶段，运用了多种生物信息学工具，对测序数据进行处理和分析，从而获取 tRNA 修饰的相关信息。

下面来看看具体的研究结果：

• Induro-tRNAseq 工作流程：研究人员使用培养的人类细胞的总 RNA 作为起始材料，而非经过凝胶或磁珠纯化的 tRNA，简化了实验步骤。通过一系列酶促反应和纯化步骤，成功构建了 Induro-tRNAseq 文库，并在 5 种人类细胞系和 3 种小鼠组织上进行测序。结果显示，该工作流程具有高质量和高重复性，大部分测序 reads 能特异性地比对到 tRNA 序列上。
• 验证 Induro-tRNAseq：通过评估保守的 tRNA 3'- 末端 CCA 序列的完整性，研究人员发现 Induro 工作流程中 tRNA 的整体质量较高。与其他 tRNAseq 方法相比，Induro 工作流程能检测到更广泛大小范围的 tRNA，尤其是线粒体 tRNA（mt - tRNA）。此外，在检测应激诱导的 tRNA 反应时，Induro 工作流程与 MSR - seq 的结果一致，进一步验证了其质量。
• Induro 对 tRNA 修饰的通读分析：研究人员对 Induro 在 tRNA 修饰上的通读能力进行了研究。发现 Induro 的通读率具有温度和时间依赖性，在 37°C 过夜时通读率最高，但考虑到实验条件的全面性和修饰检测范围，最终选择 42°C 过夜作为工作流程条件。通过实验，研究人员还确定了 Induro 在不同修饰位点的通读机制，以及该工作流程在检测修饰方面的定量准确性。
• Induro 对修饰环境的敏感性：研究表明 Induro 对修饰的化学和结构环境敏感。例如，m¹A9 和 m¹A58、m¹G9 和 m¹G37 在不同温度下的通读率变化不同，反映了它们所处结构环境的差异。此外，研究人员还测试了 Induro 在不同二价金属离子（Mg²⁺和 Mn²⁺）存在下的反应，发现 Mn²⁺能提高对某些修饰的检测能力。
• 使用 Induro 和 TGIRT 读数的两个 tRNA 修饰数据集：研究人员比较了 Induro 和 TGIRT 在 tRNA 修饰检测中的差异，发现它们在一些修饰位点的 RT 停止和错误掺入频率存在差异，且在不同序列背景下的 “读取身份” 也有所不同。这些差异和相似性为增强 tRNA 修饰分析的可信度提供了更多信息。
• tRNA 修饰在不同组织中的变化：以小鼠为模型，研究人员分析了 tRNA 修饰在不同组织中的变化。发现小脑组织中存在特异性的 tRNA 修饰变化，如 acp3U²⁰水平降低，这与修饰酶 DTWD1 的表达水平相关，表明存在脑特异性的修饰调控。
• tRNA 修饰的协调变化：研究人员发现 tRNA 修饰在不同细胞类型和组织中存在协调变化。在解码相关的反密码子茎环（ASL）区域，修饰相对稳定；而在稳定 tRNA 三级结构的非 ASL 区域，修饰变化较大。此外，还确定了一些在不同组织和细胞类型中恒定的修饰，这些修饰对稳定 tRNA 结构和提高解码质量具有重要意义。

在讨论部分，研究人员指出，他们的研究为 tRNA 修饰研究提供了全面的数据集，明确了每个可读修饰的 RT 特征，这对于当前该领域的发展至关重要。通过探索 Induro 的最佳反应条件，揭示了其通读机制，有助于更深入地理解 tRNA 修饰。同时，对不同组织和细胞类型中 tRNA 修饰协调变化的发现，为研究蛋白质稳态的维持机制提供了新的视角，为后续研究 tRNA 修饰与疾病的关系等奠定了坚实基础，有望推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。