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黑色素瘤2:视网膜色素上皮间质转化和实验性增生性玻璃体视网膜病变的有效抑制因子
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年02月05日 来源:Cell Death & Disease 8.1
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温州医科大学眼视光学院、附属眼视光医院发育细胞生物学与疾病实验室等单位的研究人员 Yu Chen、Mingyuan Jiang、Liping Li 等在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Absent in melanoma 2: a potent suppressor of retinal pigment epithelial - mesenchymal transition and experimental proliferative vitreoretinopathy” 的论文。这一研究为视网膜色素上皮 - 间充质转化(RPE - EMT)和增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发病机制提供了新见解,有望为 PVR 的治疗开辟新的潜在策略,在眼科疾病研究领域具有重要意义。
温州医科大学眼视光学院、附属眼视光医院发育细胞生物学与疾病实验室等单位的研究人员 Yu Chen、Mingyuan Jiang、Liping Li 等在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Absent in melanoma 2: a potent suppressor of retinal pigment epithelial - mesenchymal transition and experimental proliferative vitreoretinopathy” 的论文。这一研究为视网膜色素上皮 - 间充质转化(RPE - EMT)和增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发病机制提供了新见解,有望为 PVR 的治疗开辟新的潜在策略,在眼科疾病研究领域具有重要意义。
上皮 - 间充质转化(EMT)是一个复杂且关键的过程,在胚胎发育、组织再生和肿瘤进展中发挥重要作用。视网膜色素上皮(RPE)是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层上皮细胞,对维持视网膜稳态至关重要。在正常情况下,成熟的 RPE 细胞处于静止状态,但在多种视网膜疾病中,如 PVR 和年龄相关性黄斑变性(AMD),RPE 细胞会发生 EMT 并增强迁移能力。
PVR 是一种常见的视网膜疾病并发症,在开放性眼球损伤患者和视网膜脱离(RD)患者中发病率较高。RPE - EMT 是 PVR 发病机制的关键特征,其过程中 RPE 细胞会失去上皮特性,获得间充质特性,发生形态改变并表达间充质细胞标记物,如 α - 平滑肌肌动蛋白(α - SMA)和纤连蛋白(FN),最终导致 PVR 膜形成,引发牵引性 RD 和视力损害。目前,PVR 治疗面临巨大挑战,缺乏有效策略的原因之一是对 RPE - EMT 和增殖的调控机制了解不足,因此急需深入研究相关机制并开发合适的动物模型。
黑色素瘤缺失基因 2(AIM2)属于 pyrin 和 HIN 结构域蛋白家族,在免疫系统中作为异常细胞质双链 DNA(dsDNA)和应激条件的传感器发挥作用,同时在肿瘤发生中也扮演着重要角色,可抑制多种癌细胞的增殖和 EMT 过程。然而,AIM2 在 RPE - EMT 和视网膜疾病中的作用尚不明确。
伦理审批与实验动物:涉及临床样本的研究获得温州医科大学附属眼视光医院伦理委员会批准,所有受试者均提供书面同意。实验小鼠饲养于温州医科大学 SPF 设施,C57BL/6 J 小鼠购自 Charles River Laboratories of China,Aim2 基因敲除小鼠(Aim2-/-)购自 Jackson Laboratory。动物实验遵循 ARVO 关于动物使用的声明,并获得温州医科大学实验动物伦理委员会批准。
细胞培养、转染与病毒感染:原代人 RPE(phRPE)细胞从温州医科大学眼库的供体眼中分离,培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基中。针对 AIM2 的小干扰 RNA(si - AIM2 - 1、si - AIM2 - 2)及阴性对照(si - C)由 GenePharma 合成,通过 LipoJet Reagent 转染 RPE 细胞。过表达 AIM2 的慢病毒(Lv - AIM2)购自 Genechem Co., Ltd,感染 RPE 细胞后用嘌呤霉素筛选。
RNA 测序(RNA - Seq)与实时荧光定量 PCR(RT - qPCR)分析:提取原生 RPE 细胞和培养的 P3 代 phRPE 细胞的总 RNA,构建 RNA 文库进行 Illumina Novaseq 6000 测序,以 | log2(fold change)|>1 且调整后 p 值 < 0.05 为差异表达基因的筛选标准。RNA 经逆转录为 cDNA 后,进行 RT - qPCR 分析,以 GAPDH 为内参,采用 2-ΔΔCt 方法分析相对 mRNA 表达水平。
Transwell 迁移实验与凝胶收缩实验:Transwell 迁移实验用于评估细胞迁移能力,将细胞接种于上室,下室添加含 10% FBS 的培养基,培养 18 小时后固定、染色并计数迁移细胞。凝胶收缩实验中,将 RPE 细胞接种于胶原凝胶,24 小时后测量凝胶面积,评估细胞介导的凝胶收缩能力。
实验性 PVR 模型构建与药物处理:通过向 8 周龄野生型(WT)或 Aim2-/- 小鼠的视网膜下腔注射 0.25% 透明质酸钠诱导 RD,引发 PVR 样表型。Aim2-/- 小鼠在视网膜脱离模型建立后,用含 MK2206(AKT 抑制剂)的眼药水或含 DMSO 的人工泪液(对照)每天滴眼两次,持续 10 天。
免疫荧光(IF)、荧光强度定量与蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析:IF 实验中,小鼠眼球固定、切片后,用相应抗体孵育,通过共聚焦显微镜观察并拍照,用 Image J 软件量化 RPE 中 FN 的相对荧光强度。Western blotting 用于检测蛋白表达水平,提取细胞或组织中的蛋白,经 SDS - PAGE 凝胶电泳、转膜后,用相应抗体孵育,扫描蛋白条带并用 Image J 软件进行定量分析。
酶联免疫吸附测定(ELISA):使用小鼠 IL - 1β 和 IL - 18 ELISA 试剂盒检测 RPE 细胞中的炎症因子 IL - 1β 和 IL - 18,在全波长酶标仪上读取吸光度。
统计分析:实验至少重复三次,数据以均值 ± 标准差或中位数及四分位数间距表示。两组间比较采用两尾 Student's t 检验,多组间比较采用单因素方差分析(One - way ANOVA)并结合 Bonferroni 事后检验,WT 和 Aim2-/- 小鼠视网膜前或视网膜下膜面积分析采用 Mann - Whitney U 检验,P<0.05 认为具有统计学意义。
研究人员首先通过分离供体眼的 RPE 组织,进行酶解和传代培养诱导 RPE - EMT 和增殖,利用 RNA - Seq 分析差异转录组谱,筛选出在 RPE - EMT 过程中表达变化的基因,发现 AIM2 在培养的 phRPE 细胞中显著下调。接着,通过体外实验,在 phRPE 细胞中转染 siRNA 抑制 AIM2 表达或感染慢病毒过表达 AIM2,观察对 RPE 细胞增殖和 EMT 相关指标的影响。在体内实验中,利用 Aim2-/- 小鼠和 WT 小鼠构建视网膜脱离诱导的 PVR 模型,观察 AIM2 缺失对 RPE - EMT 和 PVR 进展的影响。同时,通过免疫荧光、Western blotting 等技术检测相关蛋白表达,运用 KEGG 分析探究 AIM2 调控的下游信号通路,并使用 AKT 抑制剂进行干预实验,验证信号通路在 RPE - EMT 和 PVR 中的作用。
人 RPE 细胞 EMT 过程中 AIM2 表达下调:通过体外培养 phRPE 细胞,发现随着传代次数增加,RPE 细胞逐渐呈现出 EMT 特征,如形态从上皮样变为成纤维样,增殖标记物 Ki67 表达增加。RNA - Seq 分析显示,与原生 RPE 细胞相比,P3 代培养的 phRPE 细胞中有 4529 个基因富集,3480 个基因减少,KEGG 分析表明细胞黏附、肌动蛋白细胞骨架和癌症相关通路等在该过程中差异调节。在癌症相关基因中,AIM2 在 P3 代 phRPE 细胞中显著下调,RT - qPCR 和免疫印迹分析进一步证实了 AIM2 在 RPE 细胞增殖和 EMT 过程中的表达下降。
AIM2 抑制 RPE - EMT:转染 siRNA 抑制 AIM2 表达后,P0 代 phRPE 细胞中 FN1 和 ACTA2 等 EMT 相关基因表达增加,细胞增殖率提高。而过表达 AIM2 的 phRPE 细胞(Lv - AIM2 - RPEs)中,AIM2 表达显著升高,细胞增殖受到抑制,EMT 相关蛋白如 ZO - 1 表达上调,FN、α - SMA 和 VIM 等表达下调,细胞迁移能力和胶原凝胶收缩能力也明显降低。
AIM2 缺失导致 RPE 细胞在生理条件下发生形态变化和 FN 表达增加:在 Aim2-/- 小鼠中,RPE 细胞呈现出多层化的异常形态,与 WT 小鼠的单层 RPE 细胞形成对比。IF 分析显示,Aim2-/- 小鼠 RPE 细胞中 ZO - 1 形态改变,FN 表达升高,但 Ki67 表达缺失,表明 Aim2-/- RPE 细胞在生理条件下发生细胞外基质重塑而非增殖。
AIM2 缺失促进 RPE - EMT,导致严重的实验性 PVR 进展:在视网膜脱离诱导的 PVR 小鼠模型中,Aim2-/- 小鼠的 RPE 细胞迁移到视网膜下空间,形成 PVR 膜,导致视网膜牵引和变形。免疫染色和免疫印迹分析显示,Aim2-/- RPE 细胞中 ZO - 1 表达减少,FN、α - SMA、VIM 和 N - CAD 等间充质细胞标记物表达增加,部分迁移的 RPE 细胞出现增殖。与 WT 小鼠相比,Aim2-/- PVR 小鼠的 PVR 膜形成率更高,面积更大,临床 PVR 样本中 AIM2 在 PVR 膜中的表达低于原生 RPE 细胞。
AIM2 缺失以非炎性小体依赖的方式导致 AKT 激活:在 Aim2-/- PVR 小鼠的视网膜下膜中,巨噬细胞标记物 F4/80 的 IF 分析显示巨噬细胞数量较少,且 PVR 膜中 caspase - 1 的蛋白水解切割和 IL - 1β、IL - 18 水平无显著变化,表明 AIM2 对 PVR 进展的影响不依赖于炎性小体。KEGG 分析表明 PI3K - AKT 信号通路与 RPE - EMT 相关,AIM2 过表达的 phRPE 细胞中 AKT 和 DNA - PK 的磷酸化水平降低,而 Aim2-/- PVR 小鼠的 RPE 细胞中 AKT 磷酸化水平升高。
抑制 AKT 激活可抑制 RPE - EMT 和实验性 PVR 进展:使用 AKT 抑制剂 MK2206 处理 Aim2-/- PVR 小鼠后,RPE 细胞中 AKT 磷酸化受到部分抑制,上皮标记物 ZO - 1 表达增加,间充质标记物 FN 和 α - SMA 表达减少,细胞增殖受到抑制,PVR 膜面积减小,表明抑制 AKT 激活可有效抑制 RPE - EMT 和 PVR 进展。
本研究表明,AIM2 在抑制 RPE - EMT 和实验性 PVR 进展中发挥着关键作用。AIM2 在原生 phRPE 细胞中高表达,在 RPE 细胞增殖和 EMT 过程中表达下调。过表达 AIM2 可抑制 RPE 细胞增殖和 EMT,而 AIM2 缺失则导致 RPE 细胞在生理条件下发生形态变化和细胞外基质重塑,并在 PVR 模型中促进 RPE - EMT 和增殖,引发严重的 PVR 进展。机制研究发现,AIM2 通过抑制 AKT 激活来调控 RPE - EMT 和 PVR 进展,且该过程不依赖于炎性小体。
这一研究为理解 RPE - EMT 和 PVR 的发病机制提供了新的视角,建立的人原代 RPE 细胞和 Aim2-/- 小鼠的 RD 诱导 PVR 模型有助于深入研究 RPE 细胞的调控机制。同时,研究还发现 AIM2 在不同细胞环境中的功能存在差异,其在 RPE 细胞中的高表达对维持 RPE 稳态有益,但在其他细胞中,AIM2 炎性小体的激活可能导致细胞焦亡等不同结果。
此外,虽然 AIM2 在 RPE - EMT 中的作用已明确,但在将其应用于 PVR 治疗前,还需进一步探索调节 RPE 中 AIM2 表达的精确信号,以及诱导内源性 AIM2 表达对 RPE - EMT 和 PVR 进展的影响。同时,抑制 AKT 作为治疗 AIM2 缺失相关 PVR 的策略具有一定的可行性,但仍需更多研究加以验证和完善。总之,该研究为视网膜疾病的治疗提供了潜在的新靶点和治疗思路,对推动眼科疾病治疗领域的发展具有重要意义。