深度学习驱动的全脑神经元亚群三维定位：突破性ACE管道在光片显微镜超大数据分析中的应用

本研究针对光片荧光显微镜(LSFM)产生的万亿体素级(teravoxel)全脑成像数据中神经元亚群定位的挑战，开发了基于视觉转换器(ViT)和U-Net的ACE深度学习管道。该技术实现了跨实验平台的稳健分割，结合创新的无阈值聚类增强(TFCE)统计方法，在冷诱导摄食和运动行为模型中成功定位了传统区域分析(ROI)无法检测的神经元亚群特异性激活，为神经环路研究提供了全新工具。

　　

神经科学研究长期面临一个关键挑战：如何在全脑尺度上精确绘制神经元亚群的激活模式。传统的光片荧光显微镜(LSFM)和CLARITY、iDISCO等组织透明化技术虽然能产生万亿体素(teravoxel)级的三维数据，但现有分析工具如ClearMap和Cellfinder存在明显局限。这些工具要么依赖预定义的脑图谱区域(ROI)进行统计分析，可能掩盖亚区域特异性变化；要么采用基于二维的细胞检测算法，难以准确评估三维结构变化；更关键的是，传统图像处理方法需要专家干预调参，在跨实验数据上表现不稳定。

多伦多大学等机构的研究团队在《Nature Methods》发表的这项研究，开发了名为ACE（人工智能驱动的神经元集群绘图）的全自动分析管道。该系统整合了前沿的深度学习架构和创新的统计方法，首次实现了全脑尺度神经元亚群活动的无偏三维定位。研究通过两个典型神经行为模型——冷应激诱导摄食和自主运动，验证了ACE在发现传统方法无法检测的亚区域神经元集群方面的独特优势。

研究采用多项关键技术：1) 基于18个TRAP2-Ai9转基因小鼠的LSFM数据集，开发了包含视觉转换器(UNETR)和3D U-Net的集成模型；2) 利用蒙特卡洛dropout技术生成50个模型集成，提供体素级不确定性评估；3) 结合MIRACL平台实现与Allen脑图谱(ARA)的配准；4) 创新性应用无阈值聚类增强(TFCE)算法进行全脑统计分析；5) 通过冷应激(4°C vs 30°C)和运动(跑步机vs居家笼)两个行为实验模型验证系统性能。

ACE算法流程与验证部分显示，研究团队设计的UNETR模型采用12个transformer块处理96³体素的图像块，通过多头注意力机制捕捉长程依赖关系。与优化后的Ilastik模型相比，ACE的Dice相似系数(DSC)平均提高0.17(P<0.0001)，95%豪斯多夫距离(HD₉₅)降低51%。在未见数据集上，ACE保持0.73±0.02的DSC，显著优于Ilastik的0.45±0.12。特别值得注意的是，ACE通过集成50个ViT模型生成的体素级不确定性图谱，能可靠识别神经元胞体边界等易错区域。

冷诱导摄食行为的神经机制研究发现，ACE不仅确认了下丘脑室旁核(PVH)等已知区域的激活，更首次在丘脑室旁核(PVT)背侧亚区检测到传统ROI分析遗漏的显著集群(P<0.01)。通过逆向配准至原始空间验证，冷处理组在PVT特定亚区的c-Fos⁺神经元数量达23±8个，显著高于对照组的6±2个(P<0.05)。更突破性的是，ACE发现了位于第三脑室上方的"剑突核"(Xi)区域的特异性激活，该区域在传统分析中因缺乏ARA边界定义而被忽视。

在运动行为模型中，ACE揭示了传统深度6 ROI分析未能检测的外侧 hypothalamic area (LHA)亚区激活。聚类分析显示初级运动皮层(MOp)第6a层的特异性激活，该层已知接收来自运动丘脑的 thalamocortical 投射。同时，在 retrosplenial 区域发现跨多层的神经元集群激活，这些精细尺度的发现为运动神经环路研究提供了新视角。

讨论部分强调，ACE的创新性体现在三个维度：技术层面，ViT架构首次成功应用于全脑神经元分割，通过集成学习克服了组织透明化和成像参数的异质性；方法学层面，TFCE算法避免了传统体素分析(voxel-wise)的假阳性问题，又比ROI分析具有更高灵敏度；应用层面，系统能自动识别未定义图谱区域(如Xi核)的激活，支持创建功能图谱。研究还展示了ACE在药物靶点成像(如pargyline)等场景的扩展性，经微调后对异源标记物仍保持0.74±0.14的DSC。

该研究的局限包括使用"银标准"标注可能引入偏差，以及TFCE参数需要经验性设定。未来工作将整合更多细胞类型标记和电生理验证。作为开源工具，ACE已整合至MIRACL平台，其模块化设计支持扩展至多光子显微镜等其他成像模态。这项技术突破不仅为神经科学研究提供了新范式，其处理超大规模三维数据的框架也对肿瘤学、发育生物学等领域的体数据分析具有重要借鉴意义。