-
生物通官微
陪你抓住生命科技
跳动的脉搏
e3连接酶Siah2激活神经元线粒体质量控制,维持脑缺血耐受期间的能量代谢
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年02月05日 来源:Cell Death & Disease 8.1
编辑推荐:
缺血性预处理(IPC)作为一种细胞适应性保护机制,能使组织对后续潜在致死性缺血产生更强的抵抗力。线粒体在维持神经元能量稳态中占据核心地位,其功能异常与缺血性脑卒中的发病机制紧密相关。在缺血缺氧条件下,线粒体 稳态失衡,会引发活性氧(ROS)生成、线粒体膜去极化、炎症小体激活等一系列反应,最终导致细胞凋亡。因此,线粒体质量控制对于恢复细胞内稳态和维持线粒体网络的正常功能至关重要。
意大利那不勒斯 “费德里科二世” 大学医学院神经科学系药理学分部的 Maria Josè Sisalli 等人在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “The E3-ligase Siah2 activates mitochondrial quality control in neurons to maintain energy metabolism during ischemic brain tolerance” 的论文。该研究聚焦于缺血性脑耐受过程中神经元线粒体质量控制机制,首次揭示了 E3 连接酶 Siah2 在此过程中的关键作用,为缺血性脑损伤的治疗提供了全新的潜在药物靶点和理论依据,对推动缺血性脑血管疾病治疗策略的发展意义重大。
缺血性预处理(IPC)作为一种细胞适应性保护机制,能使组织对后续潜在致死性缺血产生更强的抵抗力。线粒体在维持神经元能量稳态中占据核心地位,其功能异常与缺血性脑卒中的发病机制紧密相关。在缺血缺氧条件下,线粒体稳态失衡,会引发活性氧(ROS)生成、线粒体膜去极化、炎症小体激活等一系列反应,最终导致细胞凋亡。因此,线粒体质量控制对于恢复细胞内稳态和维持线粒体网络的正常功能至关重要。
在众多参与线粒体质量控制的机制中,线粒体自噬(mitophagy)和生物发生的平衡尤为关键。线粒体自噬可通过自噬途径选择性清除受损线粒体,而线粒体生物发生则负责补充新的线粒体,以满足细胞的能量需求。已有研究表明,E3 连接酶 Siah1/2 在帕金森病和脑缺血等病理条件下,可能参与激活线粒体自噬。此外,线粒体生物发生受转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1-α(PGC-1α)的调控,其表达水平与神经元的能量需求密切相关。基于上述背景,本研究旨在探究缺血诱导的 Siah2-E3 连接酶是否通过调节线粒体自噬机制和刺激线粒体生物发生,在缺血性脑预处理中发挥神经保护作用。
实验选用 Wistar 大鼠的原代皮质神经元,包括出生后 2 - 4 天幼鼠的神经元和 16 天胚胎的神经元。此外,实验动物还使用了雄性成年 Sprague Dawley 大鼠。实验所需的质粒 pMYs-IRES-mito-RFP 和 EGFP-LC3 分别来自 Qing Deng 和 Karla Kirkegaard 的馈赠,用于干扰 Siah2 表达的 siRNA 购自 Dharmacon。
氧糖剥夺(OGD)和缺血预处理(IPC)模型:在体外,通过将皮质神经元暴露于无血清、无葡萄糖和无氧的培养基中 30 分钟(模拟 IPC)或 3 小时(模拟 OGD),构建缺血模型,之后进行复氧处理。在体内,对大鼠实施右侧大脑中动脉闭塞术,30 分钟的闭塞用于模拟 IPC,100 分钟的闭塞用于模拟缺血。
线粒体提取:运用差速离心法从皮质神经元中分离线粒体,获取膜、胞质和线粒体三个不同的组分,用于后续的蛋白质含量测定和蛋白质免疫印迹分析。
蛋白质免疫印迹(Western blot):将蛋白质样品进行 SDS - PAGE 凝胶电泳分离,随后电转移至硝酸纤维素膜上。使用针对 Siah2、PGC-1α、LC3、VDAC、α - tubulin 和 β - actin 等蛋白的特异性抗体进行孵育,通过化学发光成像系统检测蛋白条带的光密度。
免疫细胞化学(Immunocytochemistry):固定神经元后,用特异性抗体孵育,再与荧光标记的二抗结合,通过共聚焦显微镜观察 Siah2、LC3 与线粒体的共定位情况。利用 ImageJ 软件的相关插件和宏,对线粒体形态学参数(如纵横比 AR 和形状因子 FF)进行分析。
线粒体和膜电位检测:分别使用荧光染料 X - Rhod1 和 TMRE,通过共聚焦显微镜检测线粒体
含量和膜电位。
MTT 检测:基于线粒体的氧化还原能力,通过 MTT 检测评估线粒体活性,以此反映细胞损伤程度。
质粒转染:采用 Lipofectamine 2000 将质粒和 siRNA 瞬时转染到皮质神经元中,干扰 Siah2 的表达。
统计分析:使用 G - power 软件计算每组实验的样本量,实验数据均来自至少三个独立实验,采用方差分析和 Newman - Keuls 检验进行统计分析,以
为差异具有统计学意义。
本研究以原代皮质神经元和大鼠为实验对象,先通过体外 OGD 和体内大脑中动脉闭塞术构建缺血模型,模拟缺血预处理和缺血再灌注过程。对处理后的细胞和组织进行线粒体提取、蛋白质免疫印迹、免疫细胞化学、线粒体指标检测等实验技术,获取相关数据。经统计分析后,探究 Siah2 在缺血性脑耐受中的作用机制,验证 Siah2 通过调节线粒体自噬和生物发生平衡发挥神经保护作用这一假设。
使用线粒体解偶联剂羰基氰化物对三氟甲氧基苯基腙(FCCP)处理皮质神经元,诱导线粒体去极化和 Siah2 激活。实验结果显示,FCCP 处理后,线粒体膜电位显著降低,同时线粒体组分中 Siah2 的表达增加。此外,FCCP 处理还促进了微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3(LC3)从胞质形式 LC3 - I 向自噬相关形式 LC3 - II 的转化,免疫细胞化学实验证实了 Siah2 在 FCCP 处理后的线粒体上的存在,以及 LC3 - GFP 与线粒体标记物 Mito - RFP 的共定位增加。这一系列结果表明,线粒体去极化与 Siah2 介导的线粒体自噬激活之间存在关联,是线粒体质量控制激活的重要机制。
当皮质神经元暴露于 3 小时的氧糖剥夺(OGD)时,线粒体膜去极化,刺激 Siah2 蛋白表达并促进其定位于线粒体,同时 LC3 - II 蛋白表达增加,LC3 - GFP 与 Mito - RFP 的共定位显著增强,表明 OGD 期间线粒体功能障碍导致了 Siah2 介导的线粒体自噬激活。然而,在 OGD 后复氧(OGD/REOXY)过程中,线粒体的纵横比(AR)和形状因子(FF)增加,线粒体膜电位升高,线粒体钙含量降低,这表明线粒体形态从圆形(提示线粒体分裂)转变为细长且高度互联的形态(提示线粒体融合)。进一步研究发现,在复氧阶段,线粒体生物发生的关键调节因子 PGC - 1α 的表达增加,这表明在 OGD/REOXY 过程中,线粒体自噬的激活可能触发了线粒体生物发生。
在体外缺血性脑预处理(IPC)模型中,将皮质神经元暴露于 30 分钟的 OGD(模拟亚致死性缺血损伤),结果显示 Siah2 和 LC3 - II 蛋白表达增加,且在 IPC 后再进行 3 小时 OGD 时,这种增加仍然持续,但在复氧阶段,这两种蛋白的表达恢复到基础水平。免疫细胞化学实验表明,在预处理和预处理后再进行 OGD 的神经元中,LC3 与线粒体的共定位增加,而复氧则阻止了这种增加。此外,在上述实验条件下,PGC1α 的表达在 30 分钟和 3 小时 OGD 后显著降低,而在预处理后再进行 OGD 及 OGD/REOXY 的神经元中表达增加。
为了进一步验证 Siah2 的作用,研究人员使用针对 Siah2 的小干扰 RNA(siRNA)转染皮质神经元。结果发现,siRNA 能够显著降低 OGD 介导的 Siah2 激活,抑制 LC3 - I 向 LC3 - II 的转化,并阻止复氧后 PGC - 1α 蛋白表达的增加。在体外实验中,Siah2 沉默后,神经元的线粒体功能受损,IPC 对神经元的神经保护作用显著减弱;在体内实验中,向大鼠脑室内注射 siRNA 沉默 Siah2 后,与仅接受短暂大脑中动脉闭塞(tMCAO)的小鼠相比,预处理 + tMCAO 小鼠的梗死体积明显增加,这表明 Siah2 的缺失消除了 IPC 诱导的神经保护作用。
本研究表明,E3 泛素连接酶 Siah2 在 IPC 诱导的神经保护中起着关键作用,它通过协调皮质神经元在 OGD / 复氧过程中线粒体自噬和线粒体生物发生之间的平衡,维持神经元的能量代谢,从而保护神经元免受缺血损伤。具体来说,在缺血损伤期间,Siah2 被激活,促进 LC3 从 LC3 - I 向 LC3 - II 的转化,激活线粒体自噬,清除受损的线粒体;在复氧阶段,线粒体自噬的激活引发了 PGC - 1α 表达的增加,进而刺激线粒体生物发生,为神经元在缺血后恢复提供必要的能量支持。
研究还发现,Siah2 在维持线粒体功能方面具有重要作用,其缺失会导致线粒体功能受损,无法有效清除受损线粒体,进而影响神经元的存活。此外,通过基因敲低实验证实,Siah2 是 IPC 诱导神经保护的关键调节因子,其缺失能够抵消 IPC 的神经保护作用,这表明 Siah2 可能成为开发缺血性脑血管疾病新治疗策略的潜在分子靶点。
本研究为深入理解缺血性脑耐受的分子机制提供了新的视角,揭示了 Siah2 在调节线粒体质量控制和维持神经元能量代谢中的关键作用,为未来开发基于 Siah2 的靶向治疗药物奠定了理论基础,有望为缺血性脑血管疾病的治疗带来新的突破。
知名企业招聘