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METTL1通过ATF4 mRNA的m7G修饰协调皮肤鳞状细胞癌的进展
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年02月05日 来源:Cell Death Discovery 6.1
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安徽医科大学基础医学院的 Xinru Zhang、Tong Chen 等研究人员在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “METTL1 coordinates cutaneous squamous cell carcinoma progression via the m7G modification of the ATF4 mRNA” 的论文。该研究首次揭示了 METTL1 通过对 ATF4 mRNA 进行 m7G 修饰促进皮肤鳞状细胞癌(cSCC)进展的机制,为 cSCC 的治疗提供了新的潜在靶点,在皮肤癌研究领域具有重要意义。
安徽医科大学基础医学院的 Xinru Zhang、Tong Chen 等研究人员在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “METTL1 coordinates cutaneous squamous cell carcinoma progression via the m7G modification of the ATF4 mRNA” 的论文。该研究首次揭示了 METTL1 通过对 ATF4 mRNA 进行 m7G 修饰促进皮肤鳞状细胞癌(cSCC)进展的机制,为 cSCC 的治疗提供了新的潜在靶点,在皮肤癌研究领域具有重要意义。
RNA 修饰在基因表达调控中扮演关键角色,其中 N7 - 甲基鸟苷(m7G)修饰广泛存在于多种 RNA 中。甲基转移酶样蛋白 1(METTL1)是催化 m7G 修饰的关键酶,其在多种肿瘤组织和细胞系中异常表达,与肿瘤的发生、发展密切相关,但在 cSCC 中的作用尚不明确。
皮肤癌是一种具有高破坏性的恶性肿瘤,主要分为黑色素瘤和非黑色素瘤,cSCC 是非黑色素瘤的常见类型,发病率仅次于基底细胞癌。cSCC 具有高糖酵解代谢的特点,恶性程度较高,易发生转移和侵袭。目前的治疗手段存在诸多局限性,如手术、放疗和化疗会引发炎症和瘢痕,药物治疗受皮肤屏障限制,因此急需探索更有效的治疗策略。
研究人员获取了包含 36 例 cSCC 标本和 7 例正常皮肤标本的组织阵列,从患者病历中收集了年龄、性别、病理分级等临床病理参数。实验选用了 cSCC 细胞系 HSC - 1、A431 以及人良性表皮角质形成细胞 HaCaT。同时,实验还使用了慢病毒介导的 shRNA、表达野生型 METTL1 和催化失活突变体的质粒、多种抗体、相关检测试剂盒等材料。
细胞实验:通过慢病毒感染将靶向 METTL1 的 shRNA 转染到 HSC - 1 和 A431 细胞中,构建稳定敲低 METTL1 的细胞系;将表达 ATF4 的质粒转染到敲低 METTL1 的细胞中,实现 ATF4 的过表达。运用多种细胞实验技术,如 CCK - 8 法检测细胞活力、EdU 染色评估细胞增殖、Annexin V/PI 双染检测细胞凋亡、伤口愈合实验和 Transwell 实验测定细胞迁移和侵袭能力等。
动物实验:选用 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠,建立皮下移植瘤模型。将转染 shCtrl、shMETTL1、shMETTL1 + OE - Ctrl 或 shMETTL1 + OE - ATF4 的 HSC - 1 和 A431 细胞接种到裸鼠体内,定期监测肿瘤体积,实验结束后测量肿瘤重量,并进行相关指标检测。
分子生物学实验:采用 RNA 测序分析 METTL1 敲低后细胞中差异表达基因;运用 m7G 甲基化免疫沉淀 - 定量 PCR(MeRIP - qPCR)技术鉴定 METTL1 介导的 m7G 修饰靶点;通过 mRNA 稳定性实验检测 ATF4 mRNA 的稳定性;利用 Western blot、qRT - PCR 等技术检测相关蛋白和 mRNA 的表达水平。
研究人员通过免疫组化(IHC)检测 36 例 cSCC 和 7 例正常标本中 METTL1 的蛋白水平,发现肿瘤组织中 METTL1 表达显著高于正常皮肤组织,且其表达水平随肿瘤分期增加而升高。qRT - PCR 结果显示,cSCC 肿瘤组织中 METTL1 mRNA 水平也明显高于正常组织。在 cSCC 细胞系 HSC - 1 和 A431 中,METTL1 的蛋白和 mRNA 水平均显著高于对照 HaCaT 细胞,同时 cSCC 细胞系中总 RNA 和脱帽 mRNA 的 m7G 甲基化水平也显著增加。这表明 METTL1 在 cSCC 肿瘤和细胞中异常上调,具有成为治疗靶点的潜力。
利用 shRNA 构建稳定敲低 METTL1 的 HSC - 1 和 A431 细胞系,敲低成功后细胞中 METTL1 的 mRNA 和蛋白水平下降,m7G 甲基化水平也降低。CCK - 8、EdU 和集落形成实验表明,敲低 METTL1 显著抑制了 cSCC 细胞的增殖;Annexin V/PI 双染、TUNEL 染色以及相关凋亡蛋白检测发现,敲低 METTL1 诱导细胞凋亡,抗凋亡因子 BCL - 2 表达降低,促凋亡因子 BAX 表达升高。这些结果表明 METTL1 在促进 cSCC 细胞增殖和抑制细胞凋亡方面发挥关键作用。
通过伤口愈合实验、Transwell 迁移实验和 Matrigel 侵袭实验,研究人员发现敲低 METTL1 后,cSCC 细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制。在伤口愈合实验中,敲低组 24 和 48 小时后的伤口面积更大;Transwell 迁移实验和 Matrigel 侵袭实验显示,敲低 METTL1 导致 HSC - 1 和 A431 细胞的迁移和侵袭效率降低。这说明抑制 METTL1 能够有效抑制 cSCC 细胞的迁移和侵袭。
构建裸鼠皮下移植瘤模型,将转染 shCtrl 或 shMETTL1 的 HSC - 1 和 A431 细胞接种到裸鼠体内。结果显示,METTL1 敲低细胞来源的肿瘤组织中 METTL1 蛋白水平显著降低,肿瘤生长速度减慢,最终肿瘤重量减轻。同时,肿瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白和 mRNA 表达水平也降低。这表明 METTL1 在 cSCC 肿瘤体内生长过程中发挥癌基因的作用。
对 METTL1 敲低和对照细胞进行 RNA 测序,发现敲低 METTL1 导致 4017 个基因下调,3686 个基因上调,其中糖酵解代谢相关基因显著下调,包括 ATF4 等。MeRIP - qPCR 分析表明,敲低 METTL1 后,ATF4 mRNA 的 m7G 富集水平降低,且 ATF4 mRNA 稳定性下降,蛋白水平也随之降低。通过构建 ATF4 m7G 基序突变体进行双荧光素酶报告实验,进一步验证了 METTL1 对 ATF4 mRNA 的 m7G 修饰作用。此外,过表达野生型 METTL1 可提高 m7G 甲基化水平,增强 ATF4 mRNA 的稳定性和表达,而过表达催化失活的 METTL1 则无此效果。在 cSCC 肿瘤组织中,ATF4 和 METTL1 的蛋白表达呈正相关。这些结果表明 METTL1 通过其甲基转移酶活性介导 ATF4 mRNA 的 m7G 修饰,增强其稳定性和表达。
将 ATF4 质粒转染到敲低 METTL1 的 HSC - 1 和 A431 细胞中,过表达 ATF4。实验结果显示,过表达 ATF4 的细胞培养基变黄速度加快,提示营养消耗增加。Seahorse XF96 细胞外通量分析仪检测发现,过表达 ATF4 导致细胞的耗氧率(OCR)降低,细胞外酸化率(ECAR)升高,同时葡萄糖消耗、ATP 生成和乳酸浓度增加,关键代谢蛋白 GLUT - 1、HK2 和 LDHA 的表达上调。此外,过表达 ATF4 还能增加线粒体膜电位(MMP)和线粒体质量,促进细胞增殖、迁移和侵袭,逆转敲低 METTL1 对细胞生长的抑制作用。这表明 ATF4 过表达通过增强糖酵解活性促进 cSCC 进展。
将敲低 METTL1 并转染载体对照或 ATF4 过表达质粒的 HSC - 1 和 A431 细胞接种到裸鼠体内,结果显示 ATF4 过表达减轻了 METTL1 敲低对肿瘤生长和重量的抑制作用,提高了肿瘤组织中 PCNA 的蛋白和 mRNA 表达水平,促进了 cSCC 细胞在体内的增殖。这进一步证明了 METTL1 通过上调 ATF4 表达促进 cSCC 肿瘤发生。
该研究明确了 METTL1 在 cSCC 中的致癌作用,METTL1 通过对 ATF4 mRNA 进行 m7G 修饰,增强其稳定性和表达,进而促进 cSCC 细胞的增殖、迁移、侵袭以及肿瘤在体内的生长。上调 ATF4 能够抵消敲低 METTL1 产生的抗肿瘤效应,表明 METTL1 - ATF4 轴在 cSCC 的发生发展中起关键作用。
在肿瘤研究领域,METTL1 在不同肿瘤中的作用存在差异,但均与肿瘤生长调控相关。在 cSCC 中,其高表达促进肿瘤发展,为 cSCC 的治疗提供了新的潜在靶点。然而,METTL1 在皮肤基底细胞癌中的表达和作用仍需进一步研究。
代谢重编程是肿瘤的重要特征,cSCC 具有高糖酵解代谢特点。研究发现 METTL1 敲低导致糖酵解代谢相关基因下调,而 ATF4 是 METTL1 介导 m7G 修饰的关键靶点。ATF4 在多种细胞中参与糖酵解调控,在 cSCC 中,过表达 ATF4 可增强敲低 METTL1 细胞的糖酵解活性,影响关键代谢指标,如 GLUT - 1、HK2 和 LDHA 等,进一步证实了 METTL1 通过 ATF4 介导的糖酵解促进肿瘤发生。
此外,ATF4 在维持线粒体稳态方面发挥重要作用,过表达 ATF4 可防止线粒体去极化,增加线粒体质量,但同时降低 OCR。这可能与线粒体代谢在肿瘤生长中的复杂作用有关,线粒体不仅产生 ATP,其代谢中间产物对肿瘤细胞增殖和肿瘤发生也至关重要,二者关系并非简单直接。因此,METTL1 介导的 m7G 修饰在皮肤癌代谢中的意义仍需深入探索。
总的来说,该研究揭示了 METTL1 - m7G - ATF4 轴在 cSCC 中的重要作用,为理解 cSCC 的发病机制提供了新视角,为开发针对 cSCC 的新型治疗策略奠定了基础,有望推动 cSCC 临床治疗的发展。
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