RECQL4需要PARP1来招募DNA损伤，PARG去化促进了其在末端连接中的相关作用

　　

探索 RECQL4 在 DNA 损伤修复中的关键作用：PARP1 和 PARG 的协同调控机制

美国国立卫生研究院国家衰老研究所 DNA 修复科的 Mansoor Hussain 等人在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “RECQL4 requires PARP1 for recruitment to DNA damage, and PARG dePARylation facilitates its associated role in end joining” 的论文。该研究揭示了 RECQL4、PARP1 和 PARG 在 DNA 损伤修复中的协同作用机制，为理解基因组稳定性维持及相关疾病的发生发展提供了关键线索，在癌症治疗和衰老研究等领域具有重要意义。

一、研究背景

DNA 双链断裂（DSBs）是极具危害性的 DNA 损伤，可引发染色体重排、基因组不稳定甚至肿瘤发生。人体依靠多种 DNA 修复途径应对此类损伤，其中 RecQ 解旋酶家族至关重要，它们参与 DNA 复制、修复和同源重组过程，是基因组的 “守护者”。RECQL4 作为 RecQ 解旋酶家族成员，与多种人类疾病相关，如 Rothmund - Thomson 综合征等，其参与调控主要的 DNA 修复途径，具有单链 DNA 退火活性，但该活性在 DNA 修复中的具体作用尚不明确。

聚（ADP - 核糖）聚合酶 1（PARP1）参与蛋白质的 PARylation 修饰，在 DNA 损伤修复、染色质重塑等过程中发挥关键作用。PARP1 能迅速招募到 DNA 损伤位点并激活，催化自身和靶蛋白的 PARylation，促进 DNA 修复蛋白的募集。而聚（ADP - 核糖）糖水解酶（PARG）则通过水解 PAR 链，实现蛋白质的 dePARylation，逆转 PARP1 的作用，对 DNA 修复动态过程的调控不可或缺。此前研究发现 PARP1 与部分 RecQ 解旋酶存在功能联系，但 PARP1 与 RECQL4 之间的关系尚未得到充分研究。

二、研究材料与方法

1. 细胞系、转染及抗体：使用 HEK 293T、HeLa 和 U2OS 等细胞系，在特定培养基中培养并进行转染实验。实验选用多种抗体，用于免疫沉淀、免疫印迹等检测。

2. 重组蛋白：从 BL21 大肠杆菌系统纯化重组 RECQL4 蛋白，用杆状病毒 / 昆虫细胞表达系统纯化 BLM 蛋白，购买活性 PARP1 酶、PARG 和 PAR 链用于实验。

3. 实验技术与方法：运用共免疫沉淀和免疫印迹技术检测蛋白间相互作用；通过链退火试验和螺旋酶试验测定蛋白的相关活性；采用 PAR 覆盖印迹试验分析蛋白与 PAR 的结合；利用激光微照射和共聚焦显微镜观察细胞内蛋白招募情况；借助体内 DSBR 试验、RPA 置换和单链 DNA 退火试验、微同源退火试验、邻近连接试验、克隆形成试验、染色质提取和 ChIP 等多种方法，从不同角度探究相关蛋白在 DNA 损伤修复中的功能。

三、研究结果

1. 非 PARylated PARP1 刺激 RECQL4 的链退火活性：研究人员通过链退火试验，在不同浓度非 PARylated PARP1（PARP1）、PAR 链或 PARylated PARP1 存在的情况下，检测 RECQL4 和 BLM 的单链 DNA 退火活性。结果显示，非 PARylated PARP1 以剂量依赖的方式显著刺激 RECQL4 的单链 DNA 退火活性，而对 BLM 的退火活性影响较小。这表明 PARP1 对 RECQL4 退火活性的刺激具有特异性。

2. PARP1 抑制 RECQL4 催化的螺旋酶活性：利用叉状异源双链 DNA 底物，研究 PARP1 和 PAR 对 RECQL4 和 BLM 螺旋酶活性的影响。结果表明，PARP1 剂量依赖性地抑制 RECQL4 的螺旋酶活性，而 PAR 对其无明显影响；BLM 的螺旋酶活性则不受 PAR 或 PARP1 的影响。这说明 PARP1 对 RECQL4 螺旋酶活性的抑制作用具有选择性。

3. PARP1 介导的 PARylation 是 RECQL4 早期招募到 DSBs 所必需的：通过激光微照射诱导 DNA 损伤，在 U2OS 野生型（WT）和 PARP1 敲除（KO）细胞中观察 GFP 标记的 RECQL4 的招募情况。结果发现，PARP1 KO 细胞中 GFP - RECQL4 无法招募到 DSBs，而在表达 GFP - RECQL4 和 PARP1 的细胞中则可以，PARP1 抑制剂奥拉帕尼也会抑制其招募。此外，使用拓扑异构酶 II 毒药依托泊苷诱导 DNA DSBs，通过 PLA 和染色质分级分析进一步证实了 PARP1 在 RECQL4 招募中的关键作用。同时，研究还发现 PARP1 KO 或 PARPi 处理对 BLM 的招募影响较小。

4. RECQL4 与 PARP1 相互作用：通过免疫沉淀和免疫印迹实验，在 DNA 损伤前后及奥拉帕尼处理条件下，分析 Flag - RECQL4 与 PARP1 的相互作用及 RECQL4 的 PARylation 情况。结果显示，DNA 损伤显著增强二者相互作用，奥拉帕尼则抑制该作用，且 DNA 损伤会增加 RECQL4 上的 PAR 条带，表明 PARylation 在二者相互作用中起关键作用。进一步研究发现，RECQL4 的 N - 和 C - 末端区域均存在 PARylation 位点，且与 PARP1 相互作用。

5. RECQL4 在 alt - NHEJ 中的作用：为探究 RECQL4 在 DNA 修复途径中的具体作用，研究人员进行了 RPA 置换试验和微同源退火试验。结果表明，RECQL4 能够置换 RPA，促进单链 DNA 微同源退火，形成双链 DNA，且非 PARylated PARP1 能刺激该过程，PARG 可恢复被 PARP1 抑制的 RECQL4 退火活性。此外，通过免疫沉淀实验发现，PARP1 的表达和活性对 RECQL4 与 alt - NHEJ 蛋白的相互作用至关重要。

6. RECQL4 是高效 DSBR 所必需的：通过染色质提取和 ChIP 实验，研究 PARP1 对 RECQL4 染色质结合亲和力和在 DSB 位点占有率的影响。结果显示，DNA 损伤后，PARP1 调节 RECQL4 与染色质的结合及在 DSB 位点的占有率。利用细胞系进行 GFP 修复试验，发现 PARP1 和 RECQL4 在经典非同源末端连接（c - NHEJ）和替代非同源末端连接（alt - NHEJ）途径中均发挥重要作用，敲低 RECQL4 或 PARP1 会显著降低 DNA 修复能力。此外，体外 MMEJ 试验表明，dePARylation 对 RECQL4 有效促进 MMEJ 底物修复至关重要，克隆形成试验显示 RECQL4 和 PolQ 在同一 DNA 修复途径中具有协同功能。

四、研究结论与讨论

本研究揭示了 PARP1 和 PARG 对 RECQL4 在 DNA 损伤修复中功能调控的时空机制。在 alt - NHEJ 途径中，DNA 损伤发生后，PARP1 对 RECQL4 进行 PARylation 修饰，这是 RECQL4 招募到 DSB 位点的关键步骤，有助于损伤识别和初始反应；随后，PARG 去除 RECQL4 和 PARP1 上的 PARylation 标记，恢复 RECQL4 的 DNA 退火活性，促进 alt - NHEJ 修复过程。

研究还发现，PARP1 对 RECQL4 和 BLM 的链退火及螺旋酶活性影响存在差异，这可能与它们自身酶活性的强弱有关。在 alt - NHEJ 中，RECQL4 和 PolQ 可能协同作用，共同促进修复过程。此外，由于在部分癌症中存在同源重组缺陷，而 alt - NHEJ 会代偿性激活，本研究结果提示，联合抑制 RECQL4 或 PolQ 可能成为潜在的癌症治疗策略。

该研究不仅加深了人们对 DNA 损伤修复机制的理解，也为相关疾病的治疗提供了新的理论依据和潜在靶点，对癌症治疗和衰老相关疾病研究具有重要的指导意义，有望推动精准医学的发展。