近完全激活态 GPCR-Gαβγ 中间复合物的结构与功能研究：解锁 GPCR 信号转导的关键奥秘

G 蛋白偶联受体（GPCR）在多种生理和病理过程中至关重要，但其中间复合物的信号传导作用尚不清楚。研究人员以腺苷 A2A受体（A2AR）为模型，解析了中间态 GPCR-mini-Gαsβγ 复合物结构。发现其能启动限速核苷酸交换，该研究有助于理解 GPCR 信号传导复杂性。

　　在生命的微观世界里，细胞的各种活动都受到精细的调控，其中 G 蛋白偶联受体（GPCR）起着至关重要的作用。GPCR 是人类膜蛋白中最大的家族，拥有超过 800 个不同成员，它们广泛参与各种生理和病理过程，从神经信号传递到激素调节，再到免疫系统的运作。想象一下，细胞如同一个繁忙的城市，GPCR 就像是城市中的信号塔，接收和传递着各种重要信息，指挥着细胞的行为。然而，尽管科学家们已经对 GPCR 进行了大量研究，但仍有许多谜团尚未解开。

目前，虽然通过 X 射线晶体学和单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）等技术，已经解析了数百个 GPCR-G_αβγ 复合物的结构，但这些结构大多代表的是受体的完全激活状态。而实际上，GPCR 的激活过程远比这些结构所展示的复杂。多项研究表明，GPCR 的激活需要经历多个中间复合物阶段，包括预偶联和部分激活的 GPCR - G 蛋白复合物。但由于这些中间复合物非常不稳定，几乎不可能通过生化方法将其分离出来进行研究，这使得它们的结构和功能一直笼罩在神秘的面纱之下。

为了揭开这些谜团，来自美国加利福尼亚大学、南佛罗里达大学、北卡罗来纳大学教堂山分校和斯坦福大学医学院等机构的研究人员开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解 GPCR 的信号传导机制带来了新的曙光。

研究人员采用了多种先进的技术方法。首先，他们运用¹⁹F 定量核磁共振（¹⁹F - qNMR）技术，直观地观察 GPCR 在配体作用和 G 蛋白等转导子影响下的构象变化，就像给 GPCR 的动态变化过程装上了一台 “显微镜”，让研究人员能够捕捉到那些转瞬即逝的中间状态。同时，结合分子动力学（MD）模拟，从理论层面深入分析分子的运动和相互作用。此外，通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，他们成功解析了中间态 GPCR-mini-G_αsβγ 复合物的结构，为研究提供了关键的结构基础。

S4 状态与 G_αβγ 的结合及核苷酸交换

研究人员首先关注处于 S4 状态的 WT* - R291A 突变体与 G_αβγ 的结合情况。通过¹⁹F - NMR 和 native - PAGE 实验发现，S4 状态下的 A_2AR 能直接与 G_αβγ 结合。在核苷酸水解、结合和交换实验中，研究人员发现 R291A 突变体介导的 GTP 水解速率远低于完全激动剂结合的 WT* - G_αβγ（代表 S5?G_αβγ），且其水解水平不受配体影响。这表明 R291A 突变确实将复合物捕获在中间状态，便于后续研究。进一步研究发现，在 S4 - G 蛋白复合物中，GTP 结合在由 Ras 样结构域和 α - 螺旋结构域（AHD）部分开放形成的非规范结合位点（site 2），这种结合方式导致 G 蛋白的 GTPase 活性和核苷酸交换能力受限。而当复合物从 S4 转变为 S5 时，G 蛋白构象改变，GTP 能够进入规范核苷酸结合位点（site 1）。

中间态 S4-mini-G_αβγ 复合物的结构

基于上述发现，研究人员进一步解析了中间态 S4 - mini - G_αβγ 复合物的结构。他们通过将 R291A 突变体与 mini - G_αs、G_αs稳定纳米抗体 NB35 以及 Gβ₁Y₂孵育，组装出稳定的复合物。利用¹⁹F - qNMR 和 cryo - EM 技术，研究人员获得了 S4 - mini - G_αβγ 复合物在 2.6 ? 分辨率下的结构。除了主要的 S4 构象，还发现了两个动态快照 S4_d1和 S4_d2。结构分析表明，S4 状态下 G 蛋白与受体的结合相对较弱，存在一定的摆动运动。与 S5 状态相比，S4 状态下受体的细胞外正构结合口袋更松散，G 蛋白的插入过程也未完全完成。同时，研究人员还对受体的关键微开关进行了分析，发现 S4 状态下这些微开关的相互作用较弱，处于一种过渡状态。

A_2AR 在 S4 状态下功能的分子基础

为了验证 S4 和 S5 状态之间的构象转变，研究人员运用全原子高斯加速分子动力学（GaMD）模拟技术。模拟结果表明，R291A 突变促进了从 S5 状态到与 cryo - EM 结构相匹配的能量最低构象（cS4 状态）的转变。在 GDP 释放的模拟中，发现 S4 状态介导的 G 蛋白释放 GDP 的能力明显低于 S5 状态，这与前面的核苷酸交换数据相吻合。

中间态 GPCR - G_αβγ 复合物的有限核苷酸交换模型

研究人员提出了一个机制模型来解释中间态 GPCR - G 蛋白复合物中限速核苷酸交换的现象。从近完全激活的中间态转变为完全激活态时，受体的 TM6 螺旋顺时针旋转 8°，Ras 样结构域的 Cα5 螺旋逆时针旋转 2°，这使得受体与 G 蛋白的相互作用更加紧密，同时 Cα5 螺旋上升 2 ?，促使 AHD 与 Ras 样结构域分离，暴露出结合在 site 1 的 GDP，便于 GTP 从 site 2 转移到 site 1 取代 GDP。但在 S4 介导的 G 蛋白中，由于 R^7.56突变为丙氨酸（A7.56），导致分子内阳离子 - π 相互作用和分子间盐桥的丧失，AHD 呈部分开放状态，从而限制了核苷酸交换。

研究结论表明，该研究成功解析了近完全激活的中间态 GPCR - G_αβγ 复合物的结构，揭示了其在核苷酸交换和 G 蛋白激活过程中的重要作用，为理解 GPCR 信号传导的复杂性提供了关键信息。这不仅有助于我们从分子层面深入了解 GPCR 的工作机制，还为开发基于 GPCR 的药物提供了更精准的理论基础，有望通过针对特定疾病相关构象设计药物，解决信号偏向性问题，为未来的药物研发开辟新的方向。