稳健的粘膜sars - cov -2特异性T细胞有效对抗COVID-19,并在患者肺部建立多功能常驻记忆

【字体: 时间:2025年02月05日 来源:Nature Immunology 27.8

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  广州医科大学附属第一医院、呼吸疾病国家重点实验室等多单位的研究人员,包括 Airu Zhu、Zhao Chen 等众多学者,在免疫学领域权威期刊Nature Immunology上发表了题为 “Robust mucosal SARS-CoV-2-specific T cells effectively combat COVID-19 and establish polyfunctional resident memory in patient lungs” 的论文。该研究聚焦于新冠患者气道和血液中病毒特异性 T 细胞反应,为深入理解新冠免疫机制、优化疫苗研发及传染病防控策略提供了关键依据,对免疫学研究和临床实践意义重大。

  

新冠患者气道特异性 T 细胞免疫研究新突破:病毒清除与免疫记忆的关键角色


广州医科大学附属第一医院、呼吸疾病国家重点实验室等多单位的研究人员,包括 Airu Zhu、Zhao Chen 等众多学者,在免疫学领域权威期刊Nature Immunology上发表了题为 “Robust mucosal SARS-CoV-2-specific T cells effectively combat COVID-19 and establish polyfunctional resident memory in patient lungs” 的论文。该研究聚焦于新冠患者气道和血液中病毒特异性 T 细胞反应,为深入理解新冠免疫机制、优化疫苗研发及传染病防控策略提供了关键依据,对免疫学研究和临床实践意义重大。


一、研究背景


新冠疫情全球大流行,由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(SARS-CoV-2)引发,其中呼吸衰竭和严重肺炎是导致患者发病和死亡的主要原因。因此,深入了解下呼吸道的免疫反应至关重要,但获取支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织样本存在困难,且样本中 T 细胞数量稀少,限制了肺部特异性 T 细胞反应的研究。虽然此前研究已发现新冠患者肺部 T 细胞失调和炎症回路,但对肺泡空间中 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞的详细特征仍知之甚少。同时,外周血中 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞反应虽有较多研究,但存在诸多争议,如产生干扰素 -γ(IFNγ)的 T 细胞数量与疾病严重程度的关系、表达抑制标记的 T 细胞是否耗尽等,且外周 T 细胞反应与肺部反应的关联以及在肺部的作用尚不明确。此外,疫苗诱导的 T 细胞反应在突破感染中的作用已有所研究,但疫苗对肺部 T 细胞的影响尚未明晰。


二、研究材料与方法


  1. 患者招募与样本收集:2020 年 1 月至 2023 年 1 月,研究人员从广州医科大学附属第一医院招募 159 例新冠患者,通过实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)确诊。收集 122 例 BALF 样本、280 例外周血样本,部分患者提供配对样本。记录患者详细信息,样本处理后冻存待分析。

  2. 实验技术与数据分析:运用多种实验技术,如用 SARS-CoV-2 肽库刺激样本,通过细胞内细胞因子染色(ICS)评估 T 细胞反应;采用 29 色流式细胞术分析 T 细胞表型和功能;进行单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)和单细胞 T 细胞受体测序(scTCR-seq),结合体外扩增和 RNA 提取、TCR 测序等确定特异性 T 细胞克隆;对特定表位的 CD8+ T 细胞进行 Smart-seq2 分析。数据通过多种软件和统计方法处理,如 FlowJo、R 语言及相关包,以探究 T 细胞特征、功能及与临床指标关系。


三、研究结果


3.1 研究对象的人口统计学特征


研究共纳入 159 例患者,涵盖感染野生型、Delta 和 BA.5 毒株的个体,年龄中位数 64 岁,男性占 61.6%。部分患者接种疫苗后发生突破感染,部分为自然感染。患者病情分为轻症和重症,超 70% 有合并症,高血压最为常见。24 例患者提供 27 对 BALF 和外周血单个核细胞(PBMC)样本,95 例仅提供 BALF 样本,44 例提供纵向血液样本。


3.2 BALF 中强烈诱导的 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞


用 SARS-CoV-2 肽库刺激样本,通过 ICS 检测发现,患者 PT1 的配对 BALF 和 PBMC 样本中,肺部病毒特异性 T 细胞在症状出现后 16 天即可检测到,1 个月时显著增加,而外周血中维持低水平。分析更多样本发现,BALF 中病毒特异性 T 细胞反应强于 PBMC,且症状出现时间与 BALF 中病毒特异性 CD4 + 和 CD8+ T 细胞丰度正相关,BALF 与 PBMC 中特异性 T 细胞比例无相关性,表明肺部和外周免疫动态存在差异。


3.3 BALF 病毒特异性 T 细胞与改善的临床结局相关


分层分析显示,BALF 中病毒特异性 T 细胞频率在突破感染和自然感染患者间无显著差异,与疫苗接种剂量无关,提示肌肉注射新冠疫苗对黏膜 T 细胞反应影响有限。虽重症患者病程后期 BALF 中 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞水平有升高趋势,但未达统计学意义。功能研究发现,BALF 中特异性 CD8 + 和 CD4+ T 细胞呈正相关,CD8+ T 细胞与病毒载量负相关,与呼吸功能指标正相关,且与全身炎症标志物和皮质类固醇使用负相关;CD4+ T 细胞则与重症疾病标志物相关,表明两者功能不同。


3.4 BALF 特异性 T 细胞的激活和功能增强


与 PBMC 相比,BALF 中特异性 T 细胞产生更高水平的 IFNγ 和肿瘤坏死因子(TNF),反映其更强的激活状态。29 色流式细胞术分析表明,BALF 中病毒特异性 T 细胞多细胞因子产生能力更强,且疾病持续时间与 BALF 中多功能特异性 T 细胞正相关。降维分析显示 BALF 和 PBMC 中 T 细胞明显分离,BALF 中 T 细胞富含多种功能亚群,且具有更强的细胞因子产生能力、更高的激活和组织驻留标记表达,以及较低的免疫抑制分子水平,记忆亚群分析显示 BALF 中以效应记忆 T 细胞为主,这些特征可能由肺部炎症环境驱动。


3.5 BALF 特异性 T 细胞的克隆扩增增强


对 13 例患者的 16 对 BALF 和 PBMC 样本进行 scRNA-seq 和 scTCR-seq,发现 BALF 和外周血的细胞分布差异大。BALF 中 T 细胞分布在 5290 个独特克隆,PBMC 中在 10236 个。通过特定方法鉴定出 BALF 和 PBMC 中的 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞克隆,BALF 中 T 细胞克隆扩增更显著,CD8+ T 细胞比 CD4+ T 细胞更明显,且 BALF 中克隆扩增的特异性 T 细胞比例更高,TCR 多样性降低,病毒特异性 T 细胞多集中在最扩增的克隆中,与公共 TCR 库比对进一步验证了研究结果。


3.6 BALF 特异性 T 细胞的激活抗病毒转录组


对 CD4 + 和 CD8+ T 细胞进行无监督聚类,鉴定出 12 个不同簇,BALF 特异性 T 细胞主要为 CXCR3+CD4+ TEM 细胞、RBPJ+CD4+ TEM/TRM 细胞等,与 PBMC 相比,表达更高水平的效应和抗病毒基因。基因集富集分析(GSEA)表明,BALF 病毒特异性 T 细胞中与 IFNγ 反应、T 细胞激活等相关通路显著富集。功能基因模块分析显示,BALF 特异性 T 细胞中与激活、增殖等相关基因高表达,而外周相关基因和凋亡等基因下调,代谢分析揭示其代谢向 mTOR 信号、糖酵解等转变,表明 T 细胞处于高度激活而非耗尽状态。进一步比较 BALF 和 PBMC 中相同 TCR 的 T 细胞,发现其分布在不同簇,且 BALF 中的共享克隆具有更高的代谢和增殖相关基因表达。


3.7 BALF 中表位特异性 T 细胞的 Smart-seq2 分析


对 4 例携带 HLA-B*40:01 等位基因患者的 B40/N322 表位特异性 CD8+ T 细胞进行 Smart-seq2 分析,结果显示 BALF 中该特异性 CD8+ T 细胞频率显著高于 PBMC,且 BALF 中与细胞毒性、趋化性、组织驻留和细胞存活相关的基因表达更高,GSEA 证实 BALF 中 T 细胞激活、趋化等通路富集,反映出 BALF 中 T 细胞的高度激活和强大的局部反应。


3.8 病毒清除后 BALF 特异性 T 细胞功能增强


研究发现 BALF 中病毒特异性 T 细胞丰度与病毒载量呈负相关,表明其在病毒清除中的作用。病毒清除后(RNA-),BALF 中特异性 T 细胞频率显著高于清除前(RNA+),且克隆扩增增加,不同克隆动态变化不同。基因表达谱显示,病毒清除后 BALF 特异性 T 细胞中 IFNG、CD69 等基因表达升高,IFI16 等降低,而 PBMC 变化小。GSEA 和功能模块分析表明,病毒清除后 BALF 特异性 T 细胞在激活、细胞因子产生和组织迁移等通路富集,免疫细胞亚群分布改变,T 细胞与肺泡细胞相互作用减少,炎症细胞因子水平降低,表明免疫环境得到调节。


3.9 病毒清除后 BALF 特异性 T 细胞向 TRM 细胞分化


聚类分析显示,病毒清除后 BALF 病毒特异性 T 细胞中 CXCR3+CD4+ TEM 细胞和 ITGA1+CD8+ TEM/TRM 细胞增加,增殖 T 细胞减少。伪时间轨迹分析表明,特异性 CD4+ T 细胞有三条分化途径,特异性 CD8+ T 细胞有两条,主要分化为 TRM 细胞,且该轨迹主要在 BALF 中观察到,PBMC 中不明显。标记基因分析和密度图进一步证实了这一分化过程,流式细胞术结果也显示病毒清除后 BALF 中 TRM 等表型的 T 细胞占优势,表明肺部建立了准备快速响应再次感染的记忆 T 细胞群体。


四、研究结论


该研究全面分析了新冠患者气道和血液中病毒特异性 T 细胞反应。发现 BALF 中病毒特异性 T 细胞比例显著高于 PBMC,且两者无直接相关性,体现出局部和全身 T 细胞免疫的差异。肺部 T 细胞通过糖酵解代谢支持 TH1 偏向反应,虽表达抑制标记,但与功能激活相关,并非处于耗尽状态。气道病毒特异性 T 细胞在病毒清除中起关键作用,CD8+ T 细胞与改善临床结局相关,CD4+ T 细胞作用复杂。同时,肌肉注射疫苗无法有效建立强大的肺部 T 细胞免疫,凸显了开发黏膜疫苗的必要性。感染后气道特异性 T 细胞可建立持久的组织驻留记忆群体,对控制感染和长期保护意义重大。


五、研究讨论


本研究成果意义重大。首次系统地描绘了新冠患者下呼吸道 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞的表型和功能特征,揭示其在病毒清除和免疫调节中的关键作用,为理解新冠免疫机制提供了重要依据。研究指出当前肌肉注射疫苗在诱导肺部 T 细胞免疫方面存在不足,明确了开发能够诱导强大黏膜 T 细胞记忆的疫苗是未来疫苗研发的关键方向,对优化疫苗策略、防控新冠疫情具有重要指导价值。不过,研究也存在一定局限性,如受细胞数量限制,抗原库分析和交叉反应研究不够深入;对特定患者样本的依赖限制了研究的普遍性等。未来需更大规模队列和更广泛纵向采样研究,以全面阐释新冠中局部和全身 T 细胞反应的动态变化,推动免疫学研究和传染病防控的发展。


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