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胎盘造血内皮细胞向造血干细胞和祖细胞的转化
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年01月30日 来源:Cell Discovery 13.0
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中国科学院动物研究所的梁桂贤、刘石成等研究人员在《Cell Discovery》期刊上发表了题为 “Conversion of placental hemogenic endothelial cells to hematopoietic stem and progenitor cells” 的论文。这一研究在造血干细胞领域具有重要意义,为解决造血干细胞临床来源受限问题提供了新的方向和理论依据,有助于推动胎盘内皮细胞在造血细胞生成方面的临床应用。
造血干细胞和祖细胞(HSPCs)在临床治疗血液疾病中至关重要,然而其来源有限严重阻碍了临床应用。在胚胎发育过程中,造血干细胞(HSCs)源于主要动脉内膜的造血内皮(HE)细胞,经内皮 - 造血转化(EHT)产生。除了主动脉 - 性腺 - 中肾(AGM)区域这一胚胎造血器官外,哺乳动物胎盘在发育过程中也被证实是一个胚外造血器官,且小鼠胎盘含有动脉特异性 HE 细胞。此前研究虽已探索多种将细胞转化为 HSPCs 的方法,但仍存在诸多局限,如初始细胞来源受限、转化后的 HSPCs 并非真正的 HSCs 等。同时,胚胎动脉 HE 细胞能否在体外被编程为功能性 HSCs,以及胚外 HE 细胞是否具有类似潜能,这些问题都有待解答。此外,维甲酸(RA)作为一种调节细胞增殖和分化的信号分子,在 HSC 发育过程中的作用也备受关注,其对 HSC 功能的维持及在造血诱导中的潜在应用成为研究热点。
实验选用野生型 C57BL/6 小鼠和 B6 - G/R 小鼠,用于获取 AGM 组织、胎盘及进行细胞示踪。人脐带来源于首都医科大学附属北京妇产医院,用于分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。所有实验动物的使用及人体样本的采集均获得相关伦理委员会批准,且孕妇已签署知情同意书。
免疫荧光:对胚胎和胎盘进行免疫荧光检测,用于观察细胞标记物的表达。实验流程包括固定、蔗糖处理、包埋、切片、封闭、一抗孵育、二抗孵育及细胞核染色,最后通过共聚焦激光显微镜成像。
细胞分离与培养:利用流式细胞术(FACS),依据细胞表面标记物分离特定细胞群体。如通过 CD31 和 CD144 标记分离 HUVECs,用 CD44 标记富集胚胎 HE 细胞。分离后的细胞在特定培养基中培养,HUVECs 使用内皮细胞培养基,造血细胞诱导实验使用 StemSpan SFEM 等培养基。
慢病毒包装与感染:将 E4ORF1 基因克隆至慢病毒载体,转染 293T 细胞进行慢病毒包装。收集病毒上清感染 HUVECs,使其表达 E4ORF1 基因,获得 HUVEC - E4 细胞。
细胞功能检测:通过集落形成单位细胞(CFU - C)实验评估细胞的造血潜能,检测不同类型造血集落的形成情况。进行移植实验,将诱导产生的细胞与骨髓细胞混合,移植到辐照后的小鼠体内,监测受体小鼠的造血重建能力。
基因表达分析:运用定量实时 PCR(qPCR)技术检测细胞中特定基因的表达水平,以小鼠 Gapdh 或人 GAPDH 作为内参。通过批量 RNA 测序(bulk RNA - seq)和单细胞 RNA 测序(scRNA - seq)分析基因表达谱,探究细胞的分子特征和细胞类型。
研究人员首先构建了表达 E4ORF1 基因的血管龛内皮细胞(VN - ECs),即 HUVEC - E4 细胞。接着,分别从 AGM 区域和胎盘分离出 aHE 细胞和 pHE 细胞,将其与 HUVEC - E4 细胞共培养,诱导其向 HSPCs 转化。对转化后的细胞进行功能检测,包括造血集落形成能力和体内造血重建能力评估。利用单细胞转录组测序分析 aHE 细胞和 pHE 细胞诱导产生的不同细胞类型,通过转录组比较探究 pHE - iHSPCs 自我更新基因表达不足的原因。最后,研究 RA 对 pHE 细胞向具有自我更新能力的 HSPCs 转化的影响。
VN - ECs 的构建与鉴定:通过 FACS 纯化 HUVECs,转导 E4ORF1 基因获得 HUVEC - E4 细胞。经检测,53.7% 的 HUVECs 成功转导 E4ORF1 基因,且该基因表达可提高原代 ECs 在无血清 / 细胞因子条件下的存活率,同时 HUVEC - E4 细胞中 FGF2、FGFR2 和 MAPK3 等基因高表达。
aHE 细胞的诱导转化:利用 CD44 标记富集 aHE 细胞,与 HUVEC - E4 细胞共培养 7 天后,aHE 细胞向造血命运转变,获得造血形态并表达相应标记物,qPCR 检测显示造血基因表达上调,内皮基因表达下调。
aHE - iHPCs 的功能验证:39.2% 的 aHE - iHCs 表达 HSC 相关标记 c - Kit,命名为 aHE - iHPCs。CFU - C 实验表明 aHE - iHPCs 可形成多种造血集落。移植实验证实 aHE - iHPCs 群体中含有具有短期和长期造血重建能力的 HSPCs(aHE - iHSPCs),二次移植实验进一步确认了功能性 HSCs(aHE - iHSCs)的存在。
转录组分析:对 HUVEC 和 HUVEC - E4 细胞进行 bulk RNA - seq 分析,发现 E4ORF1 基因在 HUVEC - E4 细胞中高表达。GO 分析显示,HUVEC - E4 细胞中上调基因富集于血管生成和血管形态发生相关通路,同时 BMP4、Notch 信号相关基因以及与炎症反应相关的基因(如 CX3CL1 和 IL1A)也高表达。
功能验证:使用 CX3CL1 和 IL1A 的中和抗体进行实验,结果表明阻断 CX3CL1 和 IL1A 会减少诱导产生的 HSPCs 数量,说明 VN - ECs 可通过分泌 CX3CL1 和 IL1A 等细胞因子促进 HE 细胞向 iHSCs 转化。
pHE 细胞的处理与诱导:纯化 GFP 阳性的胎盘细胞以排除母体细胞污染,利用 CD44 标记富集 pHE 细胞。pHE 细胞与 HUVEC - E4 细胞共培养 7 天后,发生向造血命运的转变,获得造血形态并表达相应标记物,qPCR 检测显示内皮基因表达下调,造血基因表达上调。
pHE - iHPCs 的功能检测:pHE - iHCs 中表达 HSC 相关标记 c - Kit,CFU - C 实验表明 pHE - iHPCs 可形成多种造血集落。移植实验显示 pHE - iHPC 群体中含有具有短期和长期造血重建能力的 HSPCs(pHE - iHSPCs),但与 aHE - iHPCs 相比,pHE - iHPCs 的造血重建能力随时间下降,且二次移植实验中 pHE - iHPCs 在致死性辐照小鼠中的植入水平较低,表明其自我更新能力有限。
细胞类型鉴定:对 aHE - iHCs 和 pHE - iHCs 进行 10X Genomics-based scRNA - seq 分析,通过 UMAP 分析注释细胞类型。aHE - iHCs 鉴定出包括 aHE - iHSPC1、aHE - iHSPC2 在内的六种细胞类型,pHE - iHCs 鉴定出包括 pHE - iHSPC、pHE - iHPC 在内的六种细胞类型。
细胞类型比较:UMAP 分析显示 aHE 细胞和 pHE 细胞的造血输出大多分为两个不同区域。细胞比例分析表明,aHE - iHCs 中单核细胞和 / 或巨噬细胞占比 > 50%,而 pHE - iHCs 中髓系祖细胞最为丰富。此外,pHE 细胞产生的 iHPC 特异性表达巨核细胞相关基因,具有巨核细胞相关表型。
HSC 特征分析:利用 HSC 特征评分(hscScore)评估诱导细胞,发现 aHE - iHSPC1、aHE - iHSPC2 和 pHE - iHSPC 得分较高,与 HSC 转录特征匹配。但与体内 HSCs 相比,aHE - iHSPCs 和 pHE - iHSPCs 仍存在差异。
基因表达差异:对 aHE - iHSPC1、aHE - iHSPC2 和 pHE - iHSPC 进行转录组分析,发现 aHE - iHSPC2 中 HSC 特异性标记 Hlf 和自我更新相关基因 Hoxa9、Lmo2 和 Hoxa7 高表达。qPCR 分析进一步证实了这一结果,表明 pHE - iHSPC 的转录组与 aHE - iHSPC1 相似,但自我更新相关基因表达不足。
细胞诱导与功能检测:在 pHE 细胞与 HUVEC - E4 细胞共培养时添加 RA,结果显示 RA 处理组的 pHE 细胞向造血命运转变,且圆形细胞数量和 pHE - iHPCs 比例增加。CFU - C 实验表明,RA - pHE - iHPCs 在第二次集落形成实验中产生的集落数量增加,表明其具有更强的自我更新能力。
移植实验验证:移植实验显示,RA - pHE - iHPC 和 Ctrl - pHE - iHPC 均具有短期和长期造血重建能力,但 RA - pHE - iHPC 的嵌合率随时间增加,而 Ctrl - pHE - iHPC 的嵌合率下降。二次移植实验表明,RA - pHE - iHPC 群体中含有具有自我更新能力的 HSCs,类似 aHE - iHSCs。
细胞亚型分析:通过流式细胞术分析发现,RA 促进了 pHE - iHSPC2 的产生,qPCR 分析显示 RA - pHE - iHSPC2 中自我更新相关基因表达上调。
本研究利用工程化的 VN - ECs 成功将小鼠 AGM 区域的 aHE 细胞和胎盘的 pHE 细胞转化为诱导性 HSPCs(iHSPCs)。aHE - iHSPCs 具有长期重建和自我更新能力,类似体内真实的 HSCs;pHE 细胞可转化为具有长期分化能力但自我更新能力有限的 pHE - iHSPCs。转录组分析揭示 pHE - iHSPCs 中自我更新相关基因表达不足,而 RA 处理能够促进 pHE 细胞向具有自我更新能力的 pHE - iHSPCs 转化,提高其自我更新能力。
该研究首次详细阐述了利用工程化 VN - ECs 诱导 aHE 细胞和 pHE 细胞向 iHSPCs 转化的过程,为体外诱导 HSPCs 生成提供了新的细胞来源和方法。揭示了 pHE 细胞转化为 iHSPCs 的潜能及限制因素,并发现 RA 可增强其自我更新能力,为胎盘内皮细胞在造血细胞生成的临床应用提供了理论基础,有助于解决 HSPCs 临床来源不足的问题。
研究虽取得重要进展,但仍存在一些局限性。例如,pHE 细胞群体中是否含有 HSC - competent HE 细胞尚不明确,产后小鼠胎盘的 ECs 是否具有造血潜能也有待研究。未来研究可聚焦于胎盘不同阶段 ECs 和 / 或 HE 细胞的分子特征,进一步评估产后胎盘的医学价值。此外,对于人 HUVEC - E4 细胞分泌信号促进小鼠 HE 细胞转化的机制,以及小鼠细胞因子能否诱导人血细胞生成等问题,也需要进一步探索。
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