亨selae巴尔通体细胞内与细胞外转录组学比较

亨塞巴尔通体的转录组学分析，区分细胞外（浮游）和细胞内环境。基因表达的变化反映了细胞外基质的毒力、侵袭性和粘附性。

　　

探究胞内与胞外汉赛巴尔通体转录组差异，为感染研究提供新视角

美国杜兰大学杜兰国家灵长类研究中心免疫学部门的 Shiva Kumar Goud Gadila 等研究人员在Communications Biology期刊上发表了题为 “Comparison of transcriptomic profiles between intracellular and extracellular Bartonella henselae” 的论文。该研究通过对比胞内和胞外汉赛巴尔通体的转录组，为深入理解巴尔通体感染机制提供了关键数据，有助于开发针对巴尔通体感染的新型治疗策略，对巴尔通体研究领域意义重大。

研究背景

巴尔通体属细菌广泛存在，部分对人和动物具有致病性。汉赛巴尔通体作为猫抓病的病原体，在人类巴尔通体感染中占比颇高。这种细菌具有独特的生存方式，它既能在细胞外生长，也能在红细胞中复制，并入侵内皮细胞和单核细胞。此前研究发现，胞内巴尔通体对抗生素的敏感性降低，但其在不同细胞环境中的基因表达变化尚不明确。

在感染过程中，汉赛巴尔通体借助表面黏附素（如 BadA）附着于宿主细胞和细胞外基质蛋白，随后通过常规吞噬作用和侵袭体介导的内化机制进入细胞。进入细胞后，细菌会抑制吞噬体与溶酶体融合，从而在细胞内生存和繁殖。同时，汉赛巴尔通体感染免疫功能正常个体可引发猫抓病，而免疫功能低下或正常个体感染后还可能出现全身性感染，累及心血管、肌肉骨骼和神经系统等。

此前研究手段如定量 PCR（qPCR）和微阵列技术已对巴尔通体基因表达有所研究，但对于汉赛巴尔通体在胞内环境中的转录组特征，仍缺乏全面深入的了解。随着 RNA 测序（RNA-seq）技术的发展，其为研究细菌基因表达和调控提供了更强大的工具，本研究旨在利用该技术揭示汉赛巴尔通体在胞内和胞外环境下转录组的差异。

研究材料与方法

材料

研究选用 DH82 犬巨噬细胞系，该细胞系源自一只患有组织细胞肉瘤的 10 岁犬，常被用于多种细菌感染研究，对巴尔通体具有易感性。汉赛巴尔通体菌株为 San Antonio 2（267HO04），是一种人类临床分离株。实验中还使用了多种试剂，包括用于细胞染色的 MemBrite Fix 染色剂、免疫荧光染色的相关抗体、RNA 提取和纯化的试剂盒等。

方法

1. 感染与细菌分离：将

   个 DH82 细胞接种于 6 孔板，过夜贴壁后，用 MOI 为 1:100 的汉赛巴尔通体感染细胞。感染 48 小时后，通过离心、洗涤去除细胞外细菌，再用冰冷水裂解细胞，释放胞内细菌，通过血琼脂平板计数细菌数量。对比过滤法和渗透裂解等方法，发现渗透裂解能分离出更多活菌，因此选用该方法。

2. 细胞染色与成像：利用 MemBrite Fix 染色剂对 DH82 细胞细胞膜染色，通过免疫荧光染色区分胞内和胞外细菌，使用尼康 Ti2-E 电动荧光显微镜成像。为确保结果准确性，实验重复多次，并改变二抗染色顺序进行验证。

3. RNA 相关实验：采用 RNAscope 技术检测细菌 RNA 的活力，使用 MICROBEnrich? 试剂盒去除宿主 RNA，利用 RiboCop rRNA Depletion 试剂盒去除宿主和细菌 rRNA，之后进行 RNA 文库制备和 Illumina 测序。

4. 数据分析：使用 Lexogen 的 BlueBee 管道和多种工具（如 Seqtk、FastQC、UMI-tools、Cutadapt、BWA-MEM、featureCounts、edgeR 等）对 RNA-seq 数据进行分析，包括 UMI 序列修剪、适配器序列去除、质量检查、序列比对、去除 PCR 重复、基因表达定量和差异表达分析等。同时，利用 qRT-PCR 对部分基因表达进行验证，通过 STRING 数据库进行功能富集分析。

技术路线

研究的技术路线围绕分离胞内和胞外汉赛巴尔通体、提取 RNA、测序及数据分析展开。先感染 DH82 细胞，分离细菌后进行 RNA 提取和富集，再对 RNA 进行测序。测序数据经一系列处理和分析，确定差异表达基因，最后通过 qRT-PCR 验证和功能富集分析，深入了解基因功能和细菌在不同环境下的变化机制。

研究结果

区分侵袭细菌与表面黏附细菌

通过 MemBrite Fix 染色标记宿主细胞膜，结合巴尔通体特异性抗体染色，经透化处理区分胞内和胞外细菌。共聚焦显微镜成像显示了胞内细菌的存在，多次免疫荧光染色实验表明，胞外细菌平均占比为 12.795%。

RNAscope 技术检测细菌 RNA 活力

使用 RNAscope 技术，以阳性对照 RNA 探针（针对 DH82 细胞的 PPIB 基因）和阴性对照探针（针对枯草芽孢杆菌的 dapB 基因）优化实验方案。结果显示，针对汉赛巴尔通体 23s 核糖体 RNA 基因的 RNA 探针能有效验证细胞内存在活菌。

RNA 完整性检查和细菌 RNA 富集

利用渗透裂解从感染的 DH82 细胞中分离出细菌，经 Bioanalyzer 检测 RNA 完整性。结果显示，样本中真核生物核糖体 RNA 占主导，使用 MICROBEnrich? 试剂盒处理后，成功去除宿主的 18S、28S rRNA 和多聚腺苷酸化 mRNA，富集了细菌 RNA，后续实验选用富集后的样本进行分析。

汉赛巴尔通体 RNA-seq 分析

以 B. henselae Houston-1 菌株基因组为参考，对体外培养细菌和胞内细菌的 RNA 进行测序。结果发现，浮游细菌样本经处理后有 70 - 73% 的 reads 能映射到参考基因组，而胞内细菌样本仅有 4 - 6% 的 reads 能映射到细菌参考基因组，其余多为宿主 RNA。经两轮下采样处理后，使各样本的 reads 数量相似，为后续准确分析提供了条件。

胞内细菌基因表达

分析发现，与浮游生长条件相比，胞内生长条件下有 289 个基因表达变化≥1.5 倍，114 个基因 log2 倍变化≥2 倍且差异显著（）。其中，70 个基因表达受抑制，44 个基因表达激活。主成分分析（PCA）显示，生长条件（浮游与胞内）之间的差异约为 80%，样本内差异为 12.4%。

qRT-PCR 分析

为验证 RNA-seq 结果，对随机选择的基因进行 qRT-PCR 分析。结果显示，qRT-PCR 与 RNA-seq 实验结果具有一致性，如 groEL、groES 和 trwH1 基因在胞内细菌中表达增加，rplJ、ccrM、atpC 和 gcvH 基因表达降低。

差异表达基因功能富集分析

将差异表达基因上传至 STRING 数据库，生成了包含 79 个节点和 188 条边的相互作用网络，富集 p 值为 7.36e - 06。同时发现氧化磷酸化和核糖体两个 KEGG 途径显著富集，且 STRING 预测出 6 个聚类，其中 CL:3089 聚类中涉及细菌进入宿主细胞的四个蛋白基因在胞内环境下显著下调。

研究结论与讨论

本研究成功建立了从胞内环境分离汉赛巴尔通体的方法，并通过 RNA-seq 分析了其转录组特征。研究发现，汉赛巴尔通体在胞内环境下基因表达发生显著变化，多数与入侵、毒力和细胞外黏附相关的基因表达下调，如 BadA 等。这表明细菌进入细胞后，可能改变了其感染和生存策略。

同时，胞内细菌下调了氧化磷酸化和核糖体相关基因，推测其可能通过降低代谢速率、减少能量消耗和蛋白质合成，进入休眠或持续感染状态，以更好地在宿主细胞内存活。此外，胞内细菌中噬菌体相关基因表达上调，暗示噬菌体可能在细菌感染过程中发挥重要作用，但具体机制仍需进一步研究。

然而，本研究也存在一定局限性。使用 DH82 细胞系模型无法完全模拟真实宿主环境，缺乏功能性巨噬细胞、成熟淋巴细胞等免疫细胞，可能影响细菌毒力因子的激活和抑制。另外，细菌载量也可能影响基因表达，未来研究应关注较低 MOI 下的感染情况。

总体而言，该研究为巴尔通体感染研究提供了全面的转录组数据，有助于深入理解巴尔通体在不同环境下的适应机制，为开发新型治疗策略提供了理论依据。后续研究可在更接近真实宿主的环境中开展，进一步揭示巴尔通体感染的分子机制，为防控巴尔通体感染相关疾病奠定基础。