综合多组学分析揭示了植物寄生线虫（Meloidogyne incognita）的翻译景观

整合翻译组、转录组和蛋白质组分析，可以改进隐种曲尾丝虫病的基因组注释，揭示寄生过程中特定阶段的翻译调控，以及鉴定470个具有潜在效应作用的微肽。

　　

多组学整合解析南方根结线虫翻译调控景观：寄生机制研究新突破

在全球农业领域，根结线虫（RKNs）对农作物的危害极大，严重威胁着全球粮食安全。其中，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）作为根结线虫属中极具破坏力的物种，每年给全球农业造成的经济损失高达约 1000 亿美元。深入探究南方根结线虫的寄生机制，对于制定有效的防控策略至关重要。

近期，来自华中农业大学国家农业微生物学重点实验室以及湖北农业生物信息学重点实验室的研究人员，在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Integrative multi - omics analysis reveals the translational landscape of the plant - parasitic nematode Meloidogyne incognita” 的论文。这一研究成果为揭示南方根结线虫的寄生机制提供了全新的视角和关键线索，对深入理解植物寄生线虫与宿主植物之间的相互作用具有重要意义。

一、研究背景

转录本丰度的评估长期以来一直是监测基因表达水平变化的主要方法，但由于大多数生物学过程最终由蛋白质执行，转录本丰度与蛋白质丰度之间的低相关性使得其预测蛋白质丰度的准确性备受争议。翻译作为将遗传信息解码为功能蛋白质的关键过程，在多个层面受到精细调控，其对生物体内蛋白质合成的精准性、时效性和效率起着决定性作用，并且在响应发育和环境信号时对基因表达的快速可逆修饰至关重要。

南方根结线虫作为极具破坏力的土传害虫，其成功寄生涉及复杂的基因表达调控过程。虽然转录组和蛋白质组分析已在一定程度上揭示了根结线虫寄生机制，但它们存在局限性，转录组分析忽视了翻译调控这一关键环节，而蛋白质组分析往往只能检测到高表达蛋白质的一部分，且主要提供全局蛋白质丰度信息，无法反映翻译动态。核糖体分析（Ribo - seq）作为一项新兴技术，能够以核苷酸分辨率监测全基因组翻译动态，为全面研究根结线虫的翻译调控景观提供了有力手段。

二、研究材料与方法

（一）线虫样本采集

研究人员选用南方根结线虫，在含有土壤和沙子（1:1）的花盆中，以番茄（Solanum lycopersicum cv. Jinpeng No. 3）为寄主进行培养，培养条件设定为光照周期 16h:8h（光：暗），温度 25°C。从番茄根上收集南方根结线虫的卵块，在 25°C 的水中孵化以获取新鲜孵化的二龄幼虫（Pre - J2）；通过显微镜从碾碎的番茄根中收集三龄 / 四龄幼虫（J3/J4）和成年雌虫，将收集到的不同发育阶段的线虫样本立即置于液氮中冷冻保存。每个发育阶段均设置三个独立的生物学重复，用于后续的 RNA 测序（RNA - seq）、核糖体分析测序（Ribo - seq）和蛋白质组学文库构建。

（二）文库构建与测序

1. Ribo - seq 文库构建与测序：采用改进的方法构建 Ribo - seq 文库。先将线虫冻融粉碎，用含 0.1mg/ml 环己酰亚胺的裂解缓冲液裂解，经 RNase I 处理消化未被核糖体保护的片段，再通过 MicroSpin S - 400 柱富集核糖体 - RNA 复合物（单核糖体），提取核糖体保护片段（RPFs），按照 NEBNext Small RNA Library Prep Set 试剂盒说明制备文库，最后在 Illumina Novaseq 6000 平台上进行测序，生成 SE50 reads。

2. RNA - seq 文库构建与测序：收集不同发育阶段的线虫样本，用 TRIzol 试剂提取总 RNA，去除核糖体 RNA 后，使用 NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit 构建链特异性 RNA - seq 文库，在 Illumina Novaseq 6000 平台上测序，获得 150bp 的双端测序 reads。

（三）蛋白质相关实验

收集线虫样本并冻融研磨，用含 8M 尿素、100mM 碳酸氢铵（pH 8）的裂解缓冲液裂解，经离心、还原、烷基化、丙酮洗涤等步骤处理后，使用 Bradford Protein Assay Kit 评估蛋白质含量，通过 SDS - PAGE 检测蛋白质质量。将蛋白质用胰蛋白酶消化后，在 Thermo Scientific Q Exactive 平台上采用 label - free 方法进行质谱（MS）检测，利用 Proteome Discoverer 2.2 搜索引擎匹配南方根结线虫蛋白质数据库，设定一系列参数筛选可靠结果，并对蛋白质定量结果进行统计分析。

（四）数据分析方法

1. Ribo - seq 数据分析：使用 Fastp 软件过滤 Ribo - seq 数据中的接头、低质量 reads 和末端低质量碱基，通过 bowtie 将数据比对到 SILVA 核糖体 RNA 基因数据库去除 rRNA，用 STAR aligner 将清洗后的 reads 比对到南方根结线虫基因组，RSEM 软件生成计数表，后续进行一系列分析并对 RPFs 相关数据进行统计。

2. RNA - seq 数据处理、转录本组装和 lncRNAs 预测：用 Trimmomatic 软件过滤 RNA - seq 数据，将清洗后的 reads 比对到基因组，计算基因表达水平和相关性系数，进行转录本组装和比对，筛选符合条件的转录本预测 lncRNAs。

3. 其他分析：采用 deltaTE 方法进行差异表达分析，确定差异转录基因（DTGs）和差异翻译效率基因（DTEGs）；通过 eggNOG - mapper v2 进行基因本体（GO）注释和富集分析；预测分泌蛋白并计算相关指标，对差异表达的分泌蛋白基因分类；通过原位杂交检测潜在小分泌肽。统计分析和数据可视化借助 R 软件完成，采用 Wilcoxon 检验比较不同类型蛋白质编码基因的翻译效率。

三、研究结果

（一）基于转录组、翻译组和蛋白质组的翻译数据集特征

研究人员生成了 Pre - J2、J3/J4 和成年雌虫阶段的 Ribo - seq、RNA - seq 和定量蛋白质组学数据。经质量评估，Ribo - seq 和 RNA - seq 文库分别产生 7190 万和 5.152 亿条 clean reads，蛋白质组学研究获得 49563 条肽段，鉴定并定量了 4891 种蛋白质。对 RPFs 特征分析发现，其长度约为 28nt，主要映射到编码序列（CDS）区域，且具有 3 - nt 周期性，阅读框分析表明多数 RPFs 富集在 CDS 的第一阅读框。相关性分析和主成分分析（PCA）显示，三类文库的重复样本相关性高，且不同发育阶段样本聚类明显，说明获得了高质量的多组学数据，适合后续深入分析。

（二）多组学整合分析鉴定南方根结线虫中广泛存在的未注释翻译事件

通过 RNA - seq 数据进行转录本组装，与参考基因组注释对比，研究人员鉴定出 2713 种新转录本，分为 5 类，并从中预测出 1764 种假定的 lncRNAs。利用 RiboCode 结合 Ribo - seq 数据，在新转录本中鉴定出 820 个活跃翻译的开放阅读框（ORFs），其中 401 个编码微肽，且 29.7% 的新翻译 ORFs 来源于假定的 lncRNAs。同时，在参考基因组中鉴定出 27867 个具有翻译活性的注释 ORFs，以及多种类型的 ORFs，并通过蛋白质组学数据验证了部分稳定蛋白质的生成。可视化分析进一步验证了翻译数据集的可靠性，且多数新发现的 ORFs 未在更新的基因组中出现，表明该研究鉴定方法可靠，大量未注释的具有翻译活性的 ORFs 完善了南方根结线虫的基因组注释。

（三）南方根结线虫在寄生过程中以寄生阶段特异性方式调节基因翻译

以 Pre - J2 阶段为对照，整合 Ribo - seq 和 RNA - seq 数据集进行 deltaTE 分析，将基因分为 DTGs 和 DTEGs。研究发现，J3/J4 阶段，仅 9%（975 个）的总调节基因归因于翻译效率（TE）的变化，其中 447 个上调，528 个下调；成年雌虫阶段，约 17.5%（2756 个）的总调节基因表现出 TE 变化，1632 个上调，1124 个下调。蛋白质组学分析验证了部分 DTEGs 在蛋白质水平的变化，表明 TE 变化直接影响蛋白质丰度。Venn 分析显示，J3/J4 和成年雌虫阶段与 Pre - J2 阶段相比，同时在翻译水平调节的 DTEGs 仅占 5.8%。GO 富集分析表明，DTEGs 在 J3/J4 和成年雌虫阶段富集于与 “细胞粘附分子结合”“蛋白质结合”“催化活性” 和 “水解酶活性” 等相关的分子功能，说明南方根结线虫在寄生过程中，功能基因在翻译水平受到寄生阶段特异性调节。

（四）南方根结线虫含有具有潜在效应子功能的微肽库

基于 Ribo - seq 对 RPFs 的深度测序，研究人员鉴定出 1932 个编码微肽（少于 100 个氨基酸）的活跃翻译 sORFs，其中 470 个微肽具有潜在分泌能力，被称为潜在小分泌肽（PSSPs），52 个通过蛋白质组学数据进一步确认。PSSPs 编码基因的外显子数量分布显示，79.8%（375 个）由 2 - 3 个外显子编码，长度分布集中在 60 - 100 个氨基酸。通过原位杂交检测发现，PSSP 编码基因 Mi_25001 在 J3/J4 阶段的食管腺中呈现强信号，食管腺是植物寄生线虫效应子合成的主要部位，这表明南方根结线虫含有具有潜在效应子功能的微肽库。

（五）南方根结线虫效应子编码基因表现出更高的翻译效率

研究人员从活跃翻译的 ORFs 中鉴定出 3168 种潜在分泌蛋白（包括 470 种 PSSPs），比较潜在分泌蛋白编码基因和非分泌蛋白编码基因在转录和翻译水平的表达差异，发现潜在分泌蛋白编码基因在两个水平上的表达差异更大，且具有更高的 TE，意味着其蛋白质合成速度更快，表明南方根结线虫的效应子可能在翻译水平受到调节，促进其快速合成和分泌。通过对已发表效应子的同源搜索和 TE 计算，进一步证实南方根结线虫效应子确实在翻译水平受到调节。

（六）南方根结线虫有潜力在不改变转录本丰度的情况下调节效应子编码基因的翻译效率

研究人员鉴定出在 J3/J4 和成年雌虫阶段与 Pre - J2 阶段相比，TE 或转录本丰度存在差异调节的潜在分泌蛋白编码基因，并将其分为四类：forwarded、buffered、intensified 和 exclusive。J3/J4 阶段，大部分（82.2%，1147 个）差异调节的潜在分泌蛋白编码基因属于 forwarded 类别；成年雌虫阶段，多数属于 forwarded 和 buffered 类别。值得注意的是，J3/J4 和成年雌虫阶段分别有 56 个和 120 个潜在分泌蛋白编码基因属于 exclusive 类别，这些基因在翻译效率显著变化时，转录本丰度无相应改变，蛋白质组学分析也证实了部分基因在转录本水平不变的情况下蛋白质丰度增加，表明南方根结线虫有潜力在不改变转录本丰度的情况下调节效应子编码基因的翻译效率，促进效应子的合成。

四、研究结论与讨论

本研究通过对南方根结线虫不同寄生阶段进行翻译组、转录组和定量蛋白质组分析，全面揭示了其寄生过程中的翻译调控景观。研究发现大量未注释的翻译事件，完善了南方根结线虫的基因组注释，暗示这些新发现的蛋白质产物可能具有重要功能。同时，鉴定出 470 个具有潜在效应子功能的微肽，为研究南方根结线虫的寄生机制提供了新的潜在靶点。

翻译效率（TE）在南方根结线虫寄生过程中呈现动态变化，功能基因的 TE 调节在不同寄生阶段发挥重要作用，且效应子编码基因具有更高的 TE，部分基因可在不改变转录本丰度的情况下调节 TE，这为南方根结线虫快速合成效应子提供了一种高效机制。这一发现强调了在研究南方根结线虫寄生机制时，不能仅关注转录本丰度变化，翻译调控同样关键，忽视翻译调控可能会遗漏主要在翻译水平调控的关键效应子。

该研究成果为深入理解南方根结线虫的寄生机制提供了丰富的数据资源和理论依据，有助于开发更有效的防控策略。例如，针对具有高翻译效率的效应子编码基因或特殊的翻译调控机制设计干扰措施，阻断南方根结线虫的寄生过程，为保障全球农业生产、维护粮食安全提供了新的思路和方向，对植物寄生线虫学领域的发展具有重要推动作用。