蛋白质硫醇-烯点击化学的多模式激活策略及其在去泛素化酶活性分析中的应用

本研究针对蛋白质分析中硫醇-烯(thiol-ene)标记技术对氧敏感和激活方式单一的问题，通过化学模型、重组蛋白和细胞裂解液体系，系统比较了紫外光(UV)、可见光(blue light)和氧化还原(Mn(OAc)3)三种激活方式的效率差异。研究发现蛋白质预结合可显著提升标记效率并克服氧抑制，成功实现了去泛素化酶(DUBs)的选择性标记，为蛋白质互作研究提供了新型可控工具。

　　

在细胞信号传导的精密调控网络中，泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system)扮演着核心角色。作为该系统的重要调节者，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)通过移除底物蛋白上的泛素(ubiquitin)标记，参与调控包括细胞周期、DNA修复和免疫应答等关键生理过程。然而，由于DUB家族成员众多且活性调控复杂，开发特异性研究工具成为领域内的重要挑战。传统活性探针(activity-based probes, ABPs)存在时空控制不足等问题，亟需发展新型标记策略。

都柏林圣三一学院的研究团队在《Communications Chemistry》发表的研究中，创新性地将硫醇-烯点击化学(thiol-ene click chemistry)应用于DUBs的活性分析。他们设计了一种含有烯烃修饰的泛素探针HA-1-75Ub-alkene，通过系统比较紫外光引发剂Irgacure 2959、可见光引发剂Mes-Acr⁺和氧化还原引发剂Mn(OAc)₃在不同体系中的表现，揭示了蛋白质预结合对反应效率的关键影响。研究采用化学模型验证基础反应特性后，依次在重组OTUB1/USP2/USP7蛋白和HEK293T细胞裂解液中进行功能验证，通过SDS-PAGE和Western Blot分析标记效率。

关键技术包括：(1)利用内含肽(intein)介导的蛋白半合成法制备烯烃修饰探针；(2)建立紫外(254 nm)、蓝光(450 nm)和氧化还原三种激活体系；(3)通过去氧实验比较不同体系对氧气的敏感性；(4)使用非DUB蛋白BSA和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)验证标记特异性。

化学模型研究

在简单硫醇(N-Boc-L-半胱氨酸甲酯)与烯丙醇的模型反应中，紫外引发效率最高(产率84%)，可见光引发需延长至6小时(转化率80%)，而Mn(OAc)₃主要导致二硫键形成(产率46%)。值得注意的是，除氧处理能显著提升所有体系效率，这与后续蛋白质体系的结果形成鲜明对比。

蛋白质预结合的关键作用

当使用重组OTUB1时，Mn(OAc)₃在低浓度(125 μM)即可实现高效标记，证明蛋白质预结合使活性位点半胱氨酸(Cys)与烯烃空间临近，有效抑制了二硫键副反应。这一现象在细胞裂解液实验中得到进一步验证：三种激活方式均成功标记内源性DUBs，且除Irgacure 2959外，其余两种方式在含氧环境中效率更高。

标记条件优化

时间梯度实验显示，紫外激活仅需2分钟，蓝光激活通过提高LED功率(90 W)可缩短至2分钟，而氧化还原体系需60分钟达到最大标记。浓度测试表明Irgacure 2959(250 μM)和Mes-Acr⁺(100 μM)在细胞裂解液中具有最佳信噪比，Mn(OAc)₃则需较高浓度(5 mM)。

特异性验证

使用BSA和β-半乳糖苷酶的对照实验证实，标记严格依赖DUBs与泛素探针的特异性结合，非特异性硫醇几乎不反应。银染(silver stain)分析显示引发剂浓度过高会导致蛋白降解，但优化条件下未观察到明显毒性。

这项研究的重要意义在于：首次系统比较了硫醇-烯标记的多种激活策略，突破性地发现蛋白质预结合可克服化学模型中的氧敏感缺陷，使可见光和氧化还原激活成为可能。所建立的蓝光激活体系(λ=450 nm)相比传统紫外光更生物友好，而Mn(OAc)₃在纯化蛋白中的高效性为开发无需光照的标记方法奠定基础。这些发现不仅拓展了点击化学在蛋白质组学中的应用场景，更为动态研究DUBs活性调控提供了时空可控的新工具。未来通过优化引发剂结构和反应条件，该技术有望应用于活细胞实时成像等更复杂的研究体系。