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腺相关病毒（AAV）肝脏基因疗法的疗效与安全性依赖衣壳选择。为解决预测 AAV 衣壳在人体肝脏中性能的难题，研究人员通过常温机器灌注（NMP）下人肝脏单细胞分析开展研究。结果发现 AAV-LK03 在肝细胞转导上优势显著等。该研究为临床 AAV 肝脏基因治疗提供关键依据。
在基因治疗领域，腺相关病毒（AAV）作为一种重要的基因载体，在肝脏疾病治疗方面展现出巨大潜力。然而，目前 AAV 肝脏基因疗法面临诸多挑战。一方面，不同 AAV 衣壳在人体肝脏中的转导效率和特异性差异较大，现有研究难以准确预测其在人体肝脏中的性能。例如，啮齿动物和非人灵长类动物研究因物种差异，高估了治疗效果；免疫缺陷小鼠实验结果又因供体特征和人源化程度不同而相互矛盾。另一方面，临床 AAV 肝脏基因治疗的应用范围有限，多数肝脏疾病需要较高比例的肝细胞转导才能有效治疗，但现有 AAV 载体剂量已达较高水平，进一步增加剂量存在安全风险，如曾有 X 连锁肌管性肌病患者因接受 AAV8 载体治疗出现肝衰竭死亡的案例。
为了突破这些困境，来自美国加利福尼亚大学旧金山分校等机构的研究人员开展了深入研究。他们旨在通过建立更接近临床条件的研究模型，准确评估不同 AAV 衣壳在人体肝脏中的性能，为临床 AAV 肝脏基因治疗提供更可靠的依据。研究结果意义重大，不仅明确了不同 AAV 衣壳在正常和脂肪变性人肝脏中的转导特性，还揭示了 AAV 衣壳和脂肪变性对载体附加体形成的影响，为优化 AAV 肝脏基因治疗方案提供了关键信息。该研究成果发表在《Nature Biotechnology》上，为该领域的发展带来了新的曙光。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是常温机器灌注（NMP）技术，利用该技术维持人肝脏在生理状态下，以模拟体内环境。其次是单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，通过对肝脏中各类细胞进行单细胞层面的分析，精确检测 AAV 衣壳的转导效率和特异性。此外，研究中还涉及数字液滴 PCR（ddPCR）等技术，用于定量分析载体 DNA 和转基因 mRNA 等。研究使用的样本来自区域器官采购组织提供的供肝，包括正常肝脏和脂肪变性肝脏。
下面来看具体的研究结果：
- AAV 衣壳在人肝脏中的测试设置：研究人员利用商用 OrganOx metra 系统对脂肪变性和纤维化的人肝脏进行长期 NMP，优化了灌注条件，如添加血液浓缩器模拟肾功能、去除残留血浆中的 AAV 衣壳中和抗体（NAbs）等，并构建自互补 AAV（scAAV）载体，确定了 AAV 载体给药后 48 小时为检测功能转导的最佳时间，成功建立了在生理条件下测试 AAV 衣壳的实验系统。
- AAV8 衣壳在正常人肝脏中的转导情况：在正常肝脏中，AAV8 衣壳不仅能高效转导肝细胞，还能转导内皮细胞和单核细胞 / 巨噬细胞。通过 scRNA-seq、免疫染色和 ddPCR 等方法检测发现，AAV8 载体的物理转导和转基因表达水平较高，且 scRNA-seq 与流式细胞术的检测结果一致。
- 不同 AAV 衣壳在正常和脂肪变性人肝脏中的比较：研究人员对比了 AAV8、AAV5、AAV-LK03、AAV6 和 AAV-NP59 这几种临床常用及在免疫缺陷小鼠实验中有潜力的 AAV 衣壳。结果显示，AAV-LK03 在肝细胞的功能转导效率最高且特异性最强，其转录效率也最高；AAV-NP59 在免疫缺陷小鼠实验中表现良好，但在人肝脏实验中的功能转导效率远低于 AAV-LK03，这表明免疫缺陷小鼠模型存在局限性。
- AAV 衣壳对肝细胞分区和脂肪变性的特异性影响：分析发现，AAV-LK03 在正常肝脏中优先转导门静脉周围的肝细胞，AAV5 在脂肪变性肝脏中则靶向中央静脉周围的肝细胞。此外，研究还确定了脂肪变性评分方法和分区评分方法的有效性，并发现高脂肪变性评分并未对 AAV 衣壳的转导效率产生负面影响。同时，研究识别出一群非分区肝细胞，AAV-LK03 对其转导效率最高，这为脂肪变性肝脏疾病的治疗提供了潜在靶点。
- AAV 衣壳和脂肪变性对载体附加体形成的影响：研究发现，脂肪变性会损害 AAV 载体的附加体连接，导致从 AAV 载体的转基因表达持久性降低。AAV5 衣壳形成的附加体相对不稳定，其连接速度比 AAV8 和 AAV-LK03 慢，从而导致长期转基因表达较低。
- AAV 衣壳对非肝细胞的特异性和共调节基因的影响：研究揭示了 AAV 载体不仅能转导肝细胞，还能转导内皮细胞和单核细胞 / 巨噬细胞。其中，AAV5 和 AAV8 对肝窦内皮细胞（LSECs）的转导效率较高，且在脂肪变性肝脏中 AAV5 对 LSECs 的转导能力更强。此外，研究还发现了一些可能参与 AAV 运输或转录的共调节基因，如 PIGR、APOC1 和 CSH2 等。
研究结论和讨论部分指出，该研究通过结合长期 NMP 和单细胞水平的功能转导定量分析，成功预测了 AAV 衣壳在正常和脂肪变性人肝脏中的性能，为临床 AAV 肝脏基因治疗提供了重要参考。研究表明，AAV-LK03 在肝细胞靶向的肝脏基因治疗中具有显著优势，可优先考虑用于临床试验，以提高治疗基因的表达并减少脱靶效应。此外，研究还发现了脂肪变性对 AAV 衣壳转导和载体附加体形成的影响，提示在临床研究设计中应考虑这些因素，以实现更持久的转基因表达。同时，研究结果为开发新的 AAV 衣壳提供了方向，有望实现对肝细胞或其他治疗相关细胞类型的高效、特异性转导，推动人类肝脏基因治疗的发展。
