GATA2突变等位基因特异性表达与GATA2缺乏综合征中HSC的低反应状态相关

　　

探索 GATA2 基因突变对造血干细胞影响的重要研究 —— 解读《GATA2 mutated allele specific expression is associated with a hyporesponsive state of HSC in GATA2 deficiency syndrome》

法国图卢兹第三大学保罗?萨巴蒂埃分校癌症研究中心（Université de Toulouse 3 Paul Sabatier, Cancer Research Centre of Toulouse）等单位的研究人员 Laetitia Largeaud、Vincent Fregona、Laura A. Jamrog 等在《Blood Cancer Journal》期刊上发表了题为 “GATA2 mutated allele specific expression is associated with a hyporesponsive state of HSC in GATA2 deficiency syndrome” 的论文。该研究创建了携带 Gata2 R396Q 错义突变的敲入小鼠模型，深入探究了 GATA2 基因突变对造血干细胞和祖细胞（HSPC）的影响，为理解 GATA2 缺陷综合征的发病机制提供了关键依据，也为改善相关疾病患者的临床治疗提供了重要思路。

一、研究背景

GATA2 作为造血过程中的关键转录因子，含有两个锌指结构域，在胚胎发育期间对 HSPC 的生成和维持起着不可或缺的作用。当 GATA2 发生异常，会导致年轻小鼠体内 HSCs 数量减少且自我更新能力丧失。过去十年间，在多种患者群体中广泛发现了 GATA2 种系突变，这些患者临床表现多样，涵盖血液系统恶性肿瘤、免疫缺陷以及血管疾病等。其中，移码突变、无义突变和增强子 + 9.5 突变通常表明发病机制为单倍体不足，而反复出现的错义突变可能具有异常活性，并且携带错义突变的患者更易发生白血病转化，但由于可用模型有限，这些错义突变在体内的影响尚未得到充分研究。造血干细胞（HSCs）位于造血层级的顶端，长期 HSCs（LT-HSCs）具备自我更新和分化能力，以维持机体一生的造血平衡。此前研究发现，Gata2 在非生理环境下（如急性髓系白血病、GATA2 缺乏症）存在等位基因特异性表达（ASE）现象。本研究旨在建立新的小鼠模型，深入探讨 Gata2 R396Q 突变对造血作用的影响，明确 HSC 功能异质性与 GATA2 基因 ASE 之间的联系，进一步理解 Gata2 种系突变患者的病理生理机制。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

实验选用 C57BL/6 N、CD45.1 B6.SJL 小鼠，Gata2+/- 小鼠由 Stuart Orkin 教授提供并回交至 C57BL/6 N 背景，Gata2 R396Q/+ 小鼠由内部 CIPHE 动物设施培育。所有实验遵循法国法律，并经当地动物实验伦理委员会批准。

（二）基因分型

从鼠耳组织（胚胎取尾巴）提取 DNA 用于基因分型 PCR，使用特定引物对 Gata2 R396Q/+ 小鼠和 Gata2+/- 小鼠进行基因分型，通过 PCR 扩增和电泳检测 DNA 条带。

（三）克隆形成实验

将人 GATA2 WT、GATA2 R204X 和 GATA2 R396Q 的 cDNA 亚克隆到 MIG 质粒并标记，产生逆转录病毒，转导小鼠谱系阴性细胞，按照说明书进行克隆形成实验。

（四）免疫荧光

用含细胞因子的 RPMI 培养基通过离心接种法转导 BAF/3 细胞，经 GFP 表达分选后固定、透化、染色，用显微镜和软件进行分析；对 E12.5 胎肝进行固定、包埋、切片等处理后，用抗体孵育、染色、观察。

（五）流式细胞术、细胞分选和数据分析

制备骨髓单细胞悬液，用特定抗体进行免疫染色，使用 EasySep 试剂盒富集谱系阴性细胞，用 BD FACSAria III 细胞分选仪分选细胞，用 FlowJo 和 FlowAI 软件分析数据。

（六）转录组分析

从纯化的 LSK 细胞中提取总 RNA，制备 RNA-seq 文库并测序，对特定 LSK 亚群纯化、提取 RNA 后制备 Smart-seq v4 文库测序，用相关软件处理数据。

（七）ATAC-Seq

用 Active-Motif ATAC-Seq 试剂盒处理分选的 LSK 群体，构建文库、测序，用多种软件评估序列质量、去除外源序列、映射到小鼠基因组，进行峰值调用和 DiffTF 分析。

（八）体内功能实验

通过腹腔注射 5 - 氟尿嘧啶诱导骨髓消融进行骨髓重建实验；给 8 周龄小鼠腹腔注射脂多糖（LPS）诱导急性炎症应激，处死小鼠后用流式细胞术分析骨髓细胞；进行 LSK 或 LT-HSC 细胞移植，检测细胞嵌合率。

（九）WGS 和 RNA-Seq

由法国医学基因组平台生成数据，具体方法详见补充材料。

（十）统计分析

使用双尾非配对 Student's t 检验或 Mann-Whitney 检验评估统计学差异，用 log-rank 检验评估生存差异，以 p<0.05 为具有统计学意义，使用 GraphPad Prism 软件进行分析。

三、研究结果

（一）GATA2 R396Q 突变破坏早期 HSC 发育

GATA2 种系错义突变多集中在第二个 C-ZF 区域，R396 是突变热点。研究构建的 Gata2 R396Q/+ 敲入小鼠模型显示，Gata2 R396Q 胚胎在 E12.5 时，卵黄囊造血结束，胎肝呈现半透明状，缺乏 CD150 造血干细胞，且出生时无 Gata2 R396Q/- 幼崽，表明该突变无法挽救野生型 Gata2 等位基因的功能。在 E14.5 时，Gata2 R396Q/+ 胚胎的胎肝 LSK 细胞数量增加，主要源于 LT-HSCs 和 MPP2 细胞增多，ST-HSC 细胞减少，这种影响持续到出生后 2 个月，且 MPP3 细胞数量也有所增加。同时，Gata2 R396Q/+ 小鼠各细胞区室中 Gata2 水平相对较高，还出现了特异性的 Gata2 CD150HighLT-HSC 群体，而 Gata2+/- 小鼠中不存在该群体。此外，Gata2 R396Q/+ 小鼠的 Gata1 和 Gata2 蛋白表达在特定细胞亚群中发生改变，提示该突变可能独立于整体 GATA2 蛋白水平影响其靶基因表达。这一系列结论是通过对不同发育阶段小鼠胚胎和幼鼠的基因分型、免疫荧光、流式细胞术等实验研究得出的。

（二）Gata2 R396Q 影响成熟造血区室

对 2 月龄 Gata2 R396Q/+ 小鼠成熟造血区室分析发现，其骨髓中 LK 祖细胞减少，主要是 CMP 和 MEP 细胞区室缩小。血液中血红蛋白和血小板计数降低，这可能是由于成熟突变细胞凋亡率增加，尽管骨髓中髓系、B 细胞和 T 细胞等成熟细胞的绝对数量相似。而这些异常在 Gata2+/- 小鼠中未被检测到，表明该错义突变具有异位功能。此结论是基于对小鼠骨髓细胞的流式细胞术分析、血液参数检测以及细胞凋亡分析等研究得出的。

（三）低反应性和炎症分子特征是 Gata2 R396Q 的标志

通过对 2 月龄 Gata2 R396Q/+ 和 Gata2+/+ 小鼠纯化的 LSK 细胞进行基因表达和染色质可及性综合分析，研究发现 Gata2 R396Q/+ 细胞中与造血定向和干扰素反应相关的 Meis 和 Irf 基序可及性降低、表达减少；与细胞静止和 BMP 信号相关的基序活性和表达增加，GATA 基序可及性仅略有下降。RNA 测序显示，Gata2 R396Q 在 LT - 和 MPP3-4 细胞中的等位基因表达水平高于野生型，呈现出独特的 ASE 模式。同时，关键 HSPC 功能基因表达降低，GSEA 分析表明多个相关通路失调。此外，突变的 LT-HSCs 表现出 HSC 特征丧失，表达非造血细胞相关基因。在染色质可及性和表达水平层面，Gata2 R396Q/+ LSK 细胞的 ORA 分析揭示了细胞过程的变化，其在先天炎症反应、迁移和细胞外基质降解等途径富集，干扰素 -γ 反应途径耗竭，表明细胞对刺激的反应能力减弱。这些结论是通过转录组分析、ATAC-Seq、基因集富集分析（GSEA）等实验技术研究得出的。

（四）Gata2 R396Q 突变损害 HSCs 发育和功能，主要在 LT-HSC 阶段

对 2 月龄小鼠进行克隆形成实验，结果显示 Gata2 R396Q/+ 细胞的 CFU-GEMM 集落显著减少，连续传代时集落数虽增加，但细胞形态和表型以颗粒前体和成熟粒细胞为主。5-FU 诱导骨髓消融后的移植实验表明，Gata2 R396Q/+ 小鼠造血重建能力降低，死亡率较高；同基因移植实验中，Gata2 R396Q/+ LSK 细胞在移植 2 个月后各亚群扩增减少，6 个月后植入缺陷更严重，二次移植进一步证实其长期植入能力丧失。LPS 刺激实验发现，Gata2 R396Q/+ 小鼠的造血细胞对炎症应激反应较弱，LT-HSCs 中出现异常的高表达 CD150 和 Sca-1、低表达 Kit 的细胞群体，且该群体在稳态和 LPS 刺激下的细胞周期活性较低，对 LPS 刺激的反应性也较差。这些结论是通过克隆形成实验、骨髓移植实验、LPS 刺激实验以及对相关细胞的表型和功能分析等研究得出的。

（五）Gata2 R396Q LT-HSCs 功能下降诱导特定的炎症衰老

研究 1 岁 Gata2 R396Q/+ 小鼠时发现，其 LSK 细胞、LT-HSC、MPP2 和 MPP3 细胞数量增加，而 MPP1 和 ST-HSC 减少，LT-HSC 数量增加在 1 岁时比 2 月龄更明显。血液参数监测显示，小鼠出现进行性贫血，血小板计数快速上升，提示造血分化偏向血小板生成。对突变 LT-HSCs 的分析发现，其与老年野生型 LT-HSCs 存在相似的失调通路，但年轻 Gata2 R396Q/+ HSPCs 中的干扰素信号和炎症标记物未升高，表明这是一种非传统的过早衰老表型。此外，还鉴定出中年 Gata2 R396Q/+ 小鼠中存在异常的 CD150high/CD41-/CD61low/- LT-HSCs，该群体功能逐渐下降，克隆形成能力和多能性降低。这部分结论是通过对不同年龄小鼠的细胞数量统计、血液参数检测、基因表达分析以及细胞功能实验等研究得出的。

（六）等位基因特异性表达驱动 LT-HSCs 功能缺陷和疾病进展

研究对 2 月龄和 12 月龄 Gata2 R396Q/+ 小鼠的 CD150high 和 CD150low LT-HSCs 进行分选，检测 Gata2 突变的 RNA 水平变异等位基因频率（VAF），发现 CD150high LT-HSCs 中的 VAF 更高，表明存在持续的 ASE 机制。将不同 CD150 表达水平的 LT-HSC 亚群进行移植实验，结果显示 CD150high LT-HSC 亚群移植后受体骨髓重建缺陷严重，而 CD150low 亚群的缺陷相对较轻。对 18 月龄 Gata2 R396Q/+ 小鼠的表型分析发现，其血红蛋白水平显著降低，脾脏肿大且有髓外造血，骨髓细胞数量大幅减少，LSK 区室主要由 CD150high LT-HSC 细胞组成，提示骨髓发育不全可能是由于功能性最强的 LT-HSCs（CD150low）耗竭。对一名携带 GATA2 R362G 种系错义突变患者的 RNA-Seq 分析证实，在白血病转化时存在 ASE，突变等位基因相对表达更高。这些结果表明 ASE 机制在人类 GATA2 缺陷综合征中具有临床相关性，可能对疾病发展和进展产生重要影响。这部分结论是通过细胞分选、VAF 检测、移植实验、患者样本分析等研究得出的。

四、研究结论与讨论

研究人员通过构建 Gata2 R396Q/+ 敲入小鼠模型，全面揭示了 GATA2 R396Q 种系突变对 HSPCs 的影响。该突变导致 LT-HSC 数量增加，但自我更新潜力下降，对炎症刺激的反应受损。尽管 GATA2 R396Q 错义突变体维持了核定位，但无法挽救野生型等位基因功能，属于整体功能丧失突变。与其他 GATA2 突变小鼠模型不同，Gata2 R396Q/+ 模型在 LSK 区室中整体 Gata2 水平未降低，反而升高，且影响了更成熟的 HSPC 区室，导致贫血和血小板增多。染色质可及性和基因表达谱分析表明，该突变影响了关键分子通路，削弱了 HSPCs 对环境信号的正常反应能力，可能导致细胞耗竭。此外，研究还发现突变的 LT-HSCs 存在独特的 CD150 高表达群体，具有类似衰老的特征，属于非传统的过早衰老表型。在 LT-HSC 区室中，CD150 高表达细胞表现出明显的低反应性，且该群体中突变等位基因表达最高，揭示了一种等位基因特异性表达机制，这种机制在小鼠早期就已存在，并且在患者血液学进展过程中可能持续存在，对理解疾病的发展和临床表型差异具有重要意义。

本研究为理解 GATA2 缺陷综合征中骨髓衰竭的起始机制提供了重要依据，显著推动了相关领域的研究进展。其研究结果对于改善 GATA2 相关疾病患者的临床随访和治疗具有潜在的指导价值，为深入探究维持 HSPC 稳态的机制提供了宝贵的见解，有助于开发更精准有效的治疗策略，从而改善患者的预后和生活质量。