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当前生物催化可利用的酶促反应有限，合成所需化合物面临挑战。研究人员针对此开展氧杂环丁烷（oxetane）对映选择性形成和开环的生物催化平台研究。成功开发该平台，能合成多种手性化合物，意义重大。
在生命科学与化学交叉的奇妙领域中，生物催化宛如一把神奇钥匙，为有机合成开启了新大门。它能利用酶驱动有机转化，在温和条件下高效且精准地制造手性分子，这在医药、化工等领域至关重要。然而，这把钥匙目前还不够万能，现有的酶促反应种类有限，许多合成化学家渴望的非天然反应，生物催化剂常常无能为力。就好比一个技艺高超的工匠，手头的工具却不够齐全，难以打造出各式各样精美的作品。
氧杂环丁烷，这个由四个原子组成、含有一个氧原子的特殊小环，别看它在自然界的产物和代谢物中不太常见，可一旦出现，往往能赋予分子强大的生物活性，在药物研发领域地位非凡。像著名的抗癌药物紫杉醇，还有治疗糖尿病的达努格列净，都有它的身影。而且，氧杂环丁烷独特的结构使其成为合成各种有机化合物、天然产物全合成、聚合物构建以及蛋白质修饰的重要 “砖石”。但它也有个让人头疼的问题，合成和转化过程中控制立体选择性极为困难，这就像在搭建一座精密的乐高模型时，每一块积木都很难准确拼接到位，可用的立体选择性合成策略少之又少。所以，开发实用高效的方法来构建和操控氧杂环丁烷的立体中心，成了现代化学研究中亟待攻克的难关。
为了解决这些难题，遵义医科大学的研究人员挺身而出。他们深入探索，发现并通过蛋白质工程改造了一种独特的卤醇脱卤酶（HHDH），精心打造出一个生物催化平台，专门用于氧杂环丁烷的对映选择性形成和开环反应。这一研究成果发表在《Nature Communications》上，犹如一颗璀璨的新星，照亮了相关领域的研究道路。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是筛选技术，他们挑选多种含 HHDH 酶的重组大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株，以 3 - 氯 - 1 - 苯基丙 - 1 - 醇的脱卤反应和 2 - 苯基氧杂环丁烷的叠氮介导开环反应为模型，筛选出催化性能较好的 HheD8 酶；二是蛋白质工程技术，借助 AlphaFold 预测 HheD8 的结构，对其活性位点附近的残基进行迭代饱和突变（ISM），定向进化出多个突变体；三是结构分析与分子动力学（MD）模拟技术，解析突变体 HheD8-M3 的晶体结构，进行分子对接和 MD 模拟，探究突变对催化效率和对映选择性的影响 。
下面让我们详细看看研究结果。
筛选 HHDHs：研究人员挑选了数十种含有 HHDH 酶的重组大肠杆菌菌株进行测试。在脱卤模型反应中，多数酶催化活性低，但 HheA5、HheC 和 HheD8 等表现出相对较好的催化效率和一定的对映选择性。在开环模型反应中，几乎所有酶催化效率都很低，只有 HheD8 和 HheD15 有一定活性，其中 HheD8 还展现出中等的 R 对映选择性。综合考虑，HheD8 被选为进一步研究的 “种子选手”。
定向进化 HheD8：由于野生型 HheD8 的结构未解析，研究人员借助 AlphaFold 获得其预测结构模型，通过分子对接确定活性位点附近 8 个关键残基，对这些残基进行迭代饱和突变。在脱卤反应筛选中，得到了如 HheD8-M4 等突变体，催化活性和对映选择性显著提升，能将 20 mM 外消旋 3 - 氯 - 1 - 苯基丙 - 1 - 醇转化为 (R)-1b，产率 49%，对映体过量值（e.e.）>99% 。在开环反应筛选中，也获得了 HheD8-M7 等优秀突变体，可将 20 mM 外消旋 2 - 苯基氧杂环丁烷转化为 (R)-1c，e.e.>99%，转化率 46% 。
结构分析和分子动力学模拟：研究人员解析了 HheD8-M3 的晶体结构，发现其整体结构与野生型相似，S117 - Y130 - R134 构成关键催化三联体。通过分析突变残基，推测 A69F 突变增强对映选择性但降低催化效率，M124P 和 R127G 突变增大活性位点口袋从而提高催化效率。MD 模拟显示，(R)-1b 在 HheD8-M3 活性位点更稳定，且 HheD8-M3 对底物亲和力更高，但热稳定性比野生型低。
对映选择性形成氧杂环丁烷的底物范围：研究人员对多种 γ- 卤代醇进行了生物催化对映选择性脱卤反应研究。结果显示，无论是带有供电子或吸电子取代基的芳基 γ- 氯代醇，还是含有萘基、杂环基以及烷基取代的底物，都能顺利反应，得到相应的手性氧杂环丁烷和 γ- 卤代醇，产率和光学纯度都较高。不过，尝试合成 3 - 取代和 2,3 - 或 2,4 - 二取代氧杂环丁烷时未成功。
对映选择性开环氧杂环丁烷的底物范围：对于氧杂环丁烷的对映选择性开环反应，芳香取代的氧杂环丁烷，无论是对位、间位还是邻位单取代，都能被有效开环，得到相应的手性 γ- 叠氮醇和氧杂环丁烷，对映选择性良好。含有嘧啶、喹啉等杂环的氧杂环丁烷以及烷基氧杂环丁烷也能发生反应。此外，反应还能接受氰化物、亚硝酸盐等亲核试剂，但氰酸盐和硫氰酸盐反应活性和对映选择性较低。
大规模反应：为了验证生物催化平台的实用性，研究人员在双相体系中提高底物浓度进行大规模反应。结果表明，在高底物浓度下，对映选择性脱卤和开环反应都能顺利进行，得到大量克级的手性化合物，产率高且对映纯度优异，充分展示了该平台在工业合成中的巨大潜力。
生物催化级联反应和对映互补合成：研究人员尝试将氧杂环丁烷的形成和开环反应整合到一个一锅、一催化剂的级联体系中。实验结果令人惊喜，多种 γ- 卤代醇在该体系中高效反应，生成手性 γ- 叠氮醇和 γ- 卤代醇，产率高且对映体纯度单一。此外，通过进一步的蛋白质工程，研究人员还获得了 S - 对映选择性的突变体 HheD8-M12，虽然其催化效率不如 HheD8-M4，但也展示了该生物催化平台操作的灵活性。
手性产物的转化：利用该生物催化平台合成的手性氧杂环丁烷和 γ- 取代醇，能进一步转化为许多有价值的化合物。比如 γ- 氯代醇 (S)-1a 可转化为抗癌药物中的重要杂环 (R)-3 - 苯基异恶唑烷，手性氧杂环丁烷 (R)-1b 能转化为 (R)-2 - 苯基四氢呋喃等，这些转化充分展示了该平台的合成可扩展性。
综合来看，研究人员成功开发的这个生物催化平台，就像为有机合成领域打造了一套超级工具。它能高效、高对映选择性地实现氧杂环丁烷的形成和开环反应，底物范围广泛，可用于制备多种手性化合物，还能进行大规模合成和一锅级联反应。这不仅为 HHDH 赋予了新的非天然功能，极大地拓展了其在合成手性分子方面的应用，还为制药和药物研发领域带来了新的希望和可能，让我们在探索生命奥秘和开发新型药物的道路上又迈出了坚实的一步。
