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微管正端追踪蛋白（+TIPs）在细胞进程中作用关键，但其凝聚形成及内部组织机制不明。研究人员聚焦 Bik1 开展相分离研究，发现其相分离依赖特定结构域，形成分形网络。该成果为理解 + TIPs 功能及蛋白相分离机制提供关键线索。
在细胞的微观世界里，微管正端追踪蛋白（+TIPs）就像一群忙碌的 “交通警察”，参与着几乎所有基于微管的细胞活动，如细胞分裂、细胞运动和细胞内信号传导等。然而，这些 “交通警察” 是如何组织起来发挥作用的，一直是科学家们渴望解开的谜题。目前，+TIPs 形成凝聚体的过程以及其内部精细的组织结构，还处于迷雾之中，这严重阻碍了我们对细胞微观机制的深入理解。为了驱散这片迷雾，来自瑞士保罗谢勒研究所（PSI）等多个研究机构的研究人员踏上了探索之旅，他们将目光聚焦在 Bik1 蛋白上，展开了一系列深入研究。这项研究成果发表在《Nature Communications》杂志上，为我们理解 + TIPs 的功能和蛋白相分离机制带来了新曙光。
研究人员主要运用了计算建模、显微镜观察、小角 X 射线散射（SAXS）和交联质谱（XL-MS）等技术方法。通过这些技术的联合运用，从不同角度对 Bik1 蛋白进行分析，从而全面深入地探究其相分离过程。
研究结果
- Bik1 的结构域组织、预测结构和相分离：研究人员利用 AlphaFold2 预测 Bik1 同二聚体结构，发现其具有特定的结构域组织，包括 N 端的 CAP-Gly 结构域、柔性连接区、中央卷曲螺旋结构域和 C 端结构域等。实验表明，Bik1 在低盐和低微摩尔浓度下易发生相分离形成微米级液滴，且 N 端 His 标签不影响其相分离行为。同时，缺失 N 端 CAP-Gly 结构域、C 端 EEY/F-like 基序或两者的截断突变体均无法形成液滴，这表明这些结构域对 Bik1 的相分离至关重要。
- Bik1 的尺寸排阻色谱 - 小角 X 射线散射分析（SEC-SAXS）：SEC-SAXS 实验显示，全长 Bik1 在溶液中主要呈伸长构象，其整体形状由双股平行卷曲螺旋结构域决定。N 端 CAP-Gly 和 C 端相关结构域通过柔性连接区与卷曲螺旋结构域相连，这些区域对整体平均形状贡献较小。
- Bik1 在稀溶液和凝聚态的定性交联质谱分析：采用定性 XL-MS 技术，研究人员发现 Bik1 在相分离过程中发生构象重排，涉及卷曲螺旋结构域内以及与 N、C 端侧翼区域的相互作用增强。同时，相分离状态下 Bik1 形成高阶寡聚体的倾向增加，且其 C 端 EEY/F-like 基序对进一步凝聚成微米级液滴很重要。
- Bik1 变体的定量交联质谱分析：通过定量 XL-MS，研究人员进一步证实相分离状态下，Bik1 卷曲螺旋结构域内以及与 CAP-Gly 结构域之间的相互作用显著增强。此外，除 Bik1ΔQQFF 外，其他变体中促进 Bik1 相分离的相互作用在低盐浓度下不受或受影响较小，而 Bik1ΔQQFF 虽能形成高阶寡聚体，但无法进一步凝聚成相分离液滴。
- 相分离 Bik1 的小角 X 射线散射分析：SAXS 测量发现，相分离的 Bik1 液滴形成分形网络，具有约 2 的分形维数，且 Bik1 二聚体在凝聚相中呈各向同性分布。这一结果为渗流理论在生物分子凝聚体中的作用提供了直接结构证据。
研究结论与讨论
研究人员通过多技术联用，成功解析了 Bik1 在稀溶液和相分离状态下的结构、动力学和相互作用，揭示了其相分离机制。研究表明，Bik1 的 N 端 CAP-Gly 结构域和 C 端 EEY/F-like 基序对其凝聚成液滴至关重要，相分离过程中 Bik1 发生构象重排，形成复杂的多价相互作用网络。此外，Bik1 液滴内形成的分形网络结构，可能使其在凝聚相保持相对低蛋白浓度的同时具有高粘度，这一特性或许与 + TIP body 在细胞内的功能相关。不过，该研究目前仅基于体外实验，其结果对酵母细胞中 + TIP body 行为和功能的影响还需进一步探究。总体而言，这项研究为深入理解复杂多结构域、寡聚蛋白的相分离机制提供了重要依据，也为后续研究其他生物分子凝聚体和 + TIP 网络奠定了坚实基础。
