固态核磁共振技术揭示枯草芽孢杆菌生物膜成熟与分散过程中的动态组分变化

本研究针对生物膜分散过程中组分与结构变化的定量表征难题，采用固态核磁共振(ssNMR)技术对枯草芽孢杆菌(B. subtilis)生物膜进行为期5天的时间分辨分析。研究人员通过非破坏性原位检测，首次揭示了成熟生物膜(48小时形成)在后续72小时内蛋白质与胞外多糖(EPS)的异步降解规律，发现生物表面活性剂(aliphatic carbons)在第4天的激增现象，并解析了不同动力学域(移动相与刚性相)对分散过程的差异化响应。该研究为理解生物膜生命周期提供了分子层面的定量框架。

　　

在微生物世界中，生物膜(biofilm)就像细菌们建造的"城市"——它们分泌胞外聚合物(EPS)形成立体矩阵，既能抵御抗生素攻击，又能共享养分。然而这座"城市"如何从繁荣走向解体，特别是其中各种"建筑材料"的降解顺序和分子机制，一直是困扰科学家的难题。传统显微技术虽能观察生物膜形态变化，却难以定量解析其内部化学成分的动态演变。

针对这一技术瓶颈，宁波大学药物发现技术研究所的研究团队创新性地运用固态核磁共振(ssNMR)技术，对模式生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCIB3610菌株的生物膜开展了为期5天的高精度"分子CT扫描"。这项发表在《npj Biofilms and Microbiomes》的研究，首次实现了对生物膜全生命周期内组分变化的无损、原位定量追踪，揭示了基质降解的时空规律和分子动力学特征。

研究团队主要采用三大技术手段：1) ¹³C标记结合定量直接极化(DP)和交叉极化(CP)的ssNMR谱，区分检测移动相(液态特性)和刚性相(固态特性)组分；2) 二维¹³C-¹³C J-INADEQUATE和DARR谱解析分子结构；3) ¹³C自旋-晶格弛豫(T₁)和偶极-化学位移相关(DIPSHIFT)实验测定分子动力学参数。所有实验均在800 MHz核磁共振波谱仪上完成，温度控制在275K以保证样品稳定性。

【生物膜中移动相与刚性相的异步消化】

通过定量DP谱分析发现，成熟生物膜(48小时)中移动相占比高达91%，但在分散阶段(3-5天)骤降至76%。

显示总碳生物量在48小时达到峰值后急剧下降，而刚性相比例相应增加，表明移动相基质更易被降解。特别值得注意的是，蛋白质的降解高峰(第3天)比胞外多糖(第4天)提前24小时，暗示两者在生物膜中存在空间分层分布。

【移动相的组分动态图谱】

2D J-INADEQUATE谱解析显示：

蛋白质在第3天降解49.28单位，而胞外多糖同期仅降解14.18单位；但到第4天，多糖降解量反超蛋白质达33.43单位。数学推导表明这两个时间点的降解基质中，蛋白质与多糖比例分别为79:21和50:50。第4天还检测到脂肪族碳信号激增，对应可能为促进分散的生物表面活性剂。

【胞外多糖的单糖聚类特征】

PCA分析揭示：

半乳糖(Gal)基多糖在培养基中含量是生物膜内的2-8倍，而葡萄糖(Glc)基多糖则呈现相反分布。K-means聚类将8种单糖分为四类：1)GalNAc/GalN/Gal；2)细胞壁组分GlcNAc/MurNAc；3)结构支架Glc；4)侧链GlcA。这种差异分布表明Glc基多糖可能形成不溶性骨架，而Gal基多糖更易释放到环境中。

【分子动力学的相间差异】

T₁弛豫测量显示：

移动相中多糖的分子运动性在分散阶段显著降低(弛豫时间缩短)，而DIPSHIFT实验表明刚性相的序参数保持稳定(0.63-0.93)。这种反差说明移动相作为连续基质整体变硬，而刚性相可能以离散的"抗性种子"形式存在。

这项研究通过创新的ssNMR技术组合，首次绘制出生物膜分散过程的定量分子图谱。其核心发现可归纳为"三个异步"：1)蛋白质与多糖的异步降解，反映它们在基质中的空间分层；2)单糖组分的异步代谢，揭示多糖结构的异质性；3)移动相与刚性相的异步响应，暗示两者在生物膜中具有截然不同的结构角色。这些发现不仅为理解生物膜生命周期提供了新的理论框架，也为开发针对性的生物膜干预策略（如精确时序的酶处理方案）提供了分子基础。特别值得注意的是，研究揭示的刚性相"抗性种子"可能代表着生物膜中最顽固的细胞亚群，这为解释临床生物膜难以根除的现象提供了新视角。