不止是ELISA,这些新技术也能检测细胞因子

【字体: 时间:2025年01月15日 来源:生物通

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  细胞因子是免疫和炎症反应的重要介质,被广泛用作疾病的生物标志物。许多细胞因子丰度低,半衰期短,瞬时分泌,在检测上颇具挑战性,但在选择正确的方法后也能获得准确的结果。

细胞因子是免疫和炎症反应的重要介质,被广泛用作疾病的生物标志物。许多细胞因子丰度低,半衰期短,瞬时分泌,在检测上颇具挑战性,但在选择正确的方法后也能获得准确的结果。这篇文章概括了目前的细胞因子检测方法,并总结了选择技术时应考虑的因素。

传统检测方法

ELISA和PCR是最常用的细胞因子检测方法,带来了高的灵敏度和特异性。ELISA方法具有很多优势。它们操作简单,数据可通过微孔板检测仪读取,而且分析过程简单明了。不过,缺点在于流程比较耗时,对样本量的要求较高,而且存在交叉反应的风险。

在各种PCR方法中,逆转录PCR(RT-PCR)最常用于细胞因子检测。据Bethyl Laboratories的实验室运营经理Amber Miller博士介绍,“与所有PCR方法一样,RT-PCR也包含扩增步骤,也许能检测到其他方法检测不到的细胞因子。不过,研究人员应当注意,基因表达水平并不总是与蛋白质水平相关,尤其是分泌蛋白水平。”

ELISA和RT-PCR的优缺点

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新兴工具和技术

当然,研究人员的选择不止是ELISA和RT-PCR。目前也涌现出不少新的工具和技术,有助于大家更快更好地检测细胞因子。下面我们就试举几例。

• Immuno-PCR

Immuno-PCR技术由加州大学伯克利分校的研究人员开发,利用寡核苷酸标记的抗体来检测蛋白质,有点类似于ELISA。简单地说,实验是将特异性抗体固定在微孔板上,并与样本一起孵育,然后加入寡核苷酸标记的抗体,通过PCR来放大信号。

Promega公司高级研究科学家Dan Lazar解释说:“Immuno-PCR的优点是能够超灵敏地检测低丰度的细胞因子,并能结合条形码进行多重分析。不过,操作比较复杂,而且这种方法容易受到DNA污染。此外,市场上的Immuno-PCR试剂盒不多,而且价格往往比ELISA高。”

• Bio-Plex多重免疫检测

Bio-Rad的Bio-Plex多重免疫检测是基于Luminex xMAP技术,该技术采用颜色编码的微球来捕获溶液中的分析物,微球表面包被了不同的抗体。这种免疫检测具有宽的动态范围,可对同一样本中的低丰度和高丰度生物分子进行定量。

例如,Bio-Plex Pro™人类细胞因子筛选试剂盒可检测48种不同的细胞因子,只需要12.5 µL样本。据介绍,这种方法比传统的ELISA检测更快更高效,不仅节省了时间和样本,而且很容易扩展,支持高通量研究。更重要的是,多重分析有助于了解细胞因子的相互作用及其在疾病过程中的作用。

• 流式细胞术

近年来,流式细胞术在细胞因子检测中的应用正变得越来越广泛。它的一大优势在于能够确定哪些细胞正在产生感兴趣的细胞因子。此外,在检测细胞因子的同时,流式细胞术还能够检测其他因子,包括激活标志物及其他功能标志物,帮助您更深入地了解样本。

在开展这类研究时,抑制细胞因子的分泌(比如使用Monensin或Brefeldin A)至关重要。染色优化也同样重要。“评估细胞内的蛋白质需要固定和透化,但这些步骤会影响抗体染色和荧光团强度,” Miller博士说。她建议进行染色优化,以便评估表面染色是在固定和透化之前进行还是之后进行。”

• CyTOF技术

Standard BioTools的质谱流式细胞技术(CyTOF)使用金属标记抗体来评估单个细胞中的多个(> 50个)表面和功能标志物,进而深入了解表型和功能。该公司的科学内容总监Jennifer Ellis表示:“与流式细胞术相比,CyTOF技术能够同时测定多个参数,而不会出现信号重叠、自发荧光或稳定性问题。”

重要的是,CyTOF中的相邻金属通道之间不会产生信号重叠,这使得panel设计更加简单,而经过验证的CyTOF产品可进一步简化这一过程。据Ellis介绍,30个抗体的Maxpar Direct Immune Profiling Assay可作为一个骨架,在此基础上添加即用型panel,以便测定激活状态和细胞因子产生。

• 循环和连续免疫荧光

通过空间生物学技术也可以观察细胞因子的位置,包括哪些细胞在产生细胞因子以及邻近细胞有哪些。酪胺信号放大法(TSA)是一种流行的方法,它是在样本中加入未标记的一抗和HRP标记的二抗,然后再加入酪胺底物,让酪胺荧光团沉积在目标位置。之后剥离抗体,再用不同的酪胺底物重复这一过程。

另一种方法是连续免疫荧光(seqIF™),它将未标记的一抗和荧光标记的二抗结合起来进行目标检测。整个染色和成像的过程可在Lunaphore COMET™平台上自动进行,并在24小时内完成40个目标的检测。“TSA和seqIF使用的都是现成的一抗,无需偶联,不过仍需要仔细优化,包括TSA实验期间添加抗体的顺序,以及开展seqIF时孵育时间的长短,”Miller说。

• 成像质谱流式技术

成像质谱流式技术(IMC)是一种基于CyTOF的技术,也被广泛用于研究细胞因子的空间表达模式。值得注意的是,IMC具有高的灵敏度和多重分析能力,可高效揭示样本之间的关键表型差异。2019年一项发表在《Cell》上的研究利用IMC来评估144份人类乳腺肿瘤样本和50份非肿瘤样本中73种蛋白质的表达,确定了与预后相关的肿瘤和免疫生态系统。

• Lumit™免疫检测

与常规的ELISA检测相比,Promega Lumit™免疫检测采用简单的“添加-混合-读数”模式,无需洗涤步骤。它能够直接检测细胞培养孔中的细胞因子及其他分析物,无需将样本转移到单独的检测板上。

“通过最大限度减少样本处理,直接检测方案降低了可变性和操作出错的风险,” Lazar谈道。Lumit免疫检测的其他特点包括:总检测时间不到2小时,而传统的ELISA检测时间长达5小时;采用发光检测,灵敏度更高,线性范围更宽。

• 开发你自己的检测

对于文献中报道的67种人类细胞因子,不一定有现成的产品来检测感兴趣的分析物。在这种情况下,研究人员可能需要使用现有的抗体试剂,自己开发出检测方法。为此,Abcam公司提供了经过验证的抗体对,以及用户友好的Lightning Link®偶联试剂盒。

Abcam的高级科学家Mandy Lund博士称:“我们的抗体对已在多种检测和多个平台上验证过,让客户对其特异性有信心。Lightning Link偶联试剂盒只需要30秒的手动操作,就能在抗体上偶联荧光基团、色原、酶、生物素或其他标记物。”


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