STALARD：选择性靶向扩增技术实现低丰度RNA异构体的精准定量分析

《Plant Methods》：STALARD: Selective Target Amplification for Low-Abundance RNA Detection

本研究针对传统RT-qPCR在低丰度转录本定量中灵敏度不足、引物效率偏差等问题，开发了STALARD（选择性靶向扩增低丰度RNA检测）技术。该技术通过基因特异性引物与oligo(dT)结合，实现目标转录本的特异性预扩增，成功将拟南芥中VIN3、COOLAIR等低丰度转录本（Cq>30）提升至可定量范围，并联合纳米孔测序发现COOLAIR新型polyA位点。该方法为植物发育与环境响应中RNA异构体研究提供了高灵敏度、低成本的分析工具。

　　

在植物生长发育和环境应答过程中，基因表达的精确调控往往依赖于低丰度转录本及其异构体的动态变化。例如，拟南芥中FLOWERING LOCUS M（FLM）和MADS AFFECTING FLOWERING 2（MAF2）等基因通过可变剪接（Alternative Splicing, AS）产生功能各异的mRNA异构体，直接调控开花时间。然而，这些关键转录本通常表达量极低，传统逆转录定量实时聚合酶链式反应（Reverse Transcription-quantitative real-time PCR, RT-qPCR）在定量循环（Quantification Cycle, Cq）值高于30时，因重复性差而难以准确定量。此外，异构体特异性qPCR常因引物效率差异引入扩增偏倚，而转录组测序虽能全面分析RNA群体，却需深度测序和复杂生物信息学分析，成本高昂。

为解决上述瓶颈，Jeong等人在《Plant Methods》上发表了题为“STALARD: Selective Target Amplification for Low-Abundance RNA Detection”的研究，开发了一种快速（<2小时）、靶向性的两步法RT-PCR技术。该技术通过设计基因特异性引物（Gene-Specific Primer, GSP）与oligo(dT)结合的逆转录引物，在cDNA两端引入相同序列，随后仅使用单一GSP进行有限循环PCR（<12循环），实现目标转录本的特异性扩增，显著提升低丰度RNA的检测灵敏度。

关键技术方法

研究以拟南芥幼苗为材料，通过STALARD对VIN3、FLM、MAF2、EIN4、ATX2及COOLAIR等低丰度转录本进行预扩增，优化PCR循环数至12轮以平衡效率与特异性；联合qPCR和纳米孔测序验证异构体比例，并通过引物组合对比揭示COOLAIR定量不一致的根源。

研究结果

STALARD预扩增效率与循环数优化

通过VIN3转录本验证发现，未经STALARD扩增时其Cq平均值为31.55（接近定量下限），经9-18循环扩增后Cq值线性下降，而内参基因UBC21在12循环内保持稳定，超过12循环则因非特异性扩增导致信号偏移，表明12循环为最优条件。

广动态范围内的异构体定量可靠性

对FLM、MAF2（高丰度）和EIN4、ATX2（低丰度）的可变剪接分析显示，STALARD将定量范围从0.0001-1.5（传统RT-qPCR）提升至0.1-35,000，且ATX2异构体在春化处理中的表达变化仅能通过STALARD准确捕获，与传统转录组数据一致。

COOLAIR异构体定量矛盾解析

针对此前研究中COOLAIR近端/远端异构体比例在自主途径（Autonomous Pathway, AP）突变体中结果不一致的问题，STALARD-qPCR与纳米孔测序均证实fca、fld、fpa、ld突变体近端/远端比值下降，而fve和fy与野生型无显著差异，解决了引物设计导致的定量偏差。

新型polyA位点发现

纳米孔测序揭示COOLAIR存在未注释polyA位点：近端异构体中76%读段终止于注释位点下游116碱基处，远端异构体主要polyA位点下游16碱基和80碱基亦有新位点，凸显STALARD联合测序在3'端分析中的潜力。

结论与意义

STALARD通过特异性靶向扩增，突破了低丰度RNA异构体定量的技术壁垒，其操作简便、成本低廉，且兼容qPCR与长读长测序平台。该方法不仅为植物开花时间调控、环境应答等研究提供了可靠工具，更适用于任何已知5'端序列的polyA化转录本分析，为转录组精细调控研究开辟了新路径。