基于光纤激光器的受激拉曼光热显微镜：迈向高性能与用户友好的化学成像平台

《PhotoniX》：Fiber laser based stimulated Raman photothermal microscopy towards a high-performance and user-friendly chemical imaging platform

为解决传统受激拉曼散射(SRS)显微镜依赖低噪声但笨重的固态激光源、以及高数值孔径(NA)光学系统对样品要求严苛的问题，研究人员开发了一种基于光纤激光器的受激拉曼光热(SRP)显微镜。该技术利用光纤激光器的便携性，通过探测SRS过程产生的热透镜效应，实现了比光纤激光SRS高两个数量级的信噪比(SNR)提升，并允许使用低NA、长工作距离光学系统进行信号收集，将样品空间从毫米级扩展到厘米级，为多孔板、厚组织等多样化样品提供了强大的无标记化学成像平台。

　　

在生命科学和医学研究中，能够“看见”细胞和组织中特定化学键的分布，对于理解生命活动、诊断疾病至关重要。受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)显微镜就是这样一种强大的无标记化学成像技术，它无需荧光染料，就能直接“点亮”蛋白质、脂质等生物分子，在肿瘤诊断、代谢研究等领域展现出巨大潜力。

然而，这项技术目前面临两大“卡脖子”难题。首先，它严重依赖低噪声但体积庞大、价格昂贵的固态激光器。虽然近年来便携式光纤激光器在成本、稳定性和体积上优势明显，但其固有的激光强度噪声却严重限制了成像的灵敏度。其次，为了高效收集微弱的SRS信号，传统SRS显微镜必须使用高数值孔径(Numerical Aperture, NA)的物镜和聚光镜，这导致样品空间极其狭小，通常只有几毫米。这不仅限制了厚组织样品的成像，也让多孔板、活细胞培养皿等生物实验室的“标配”样品难以直接成像，极大地限制了该技术的普及和应用。

为了突破这些瓶颈，波士顿大学程继新(Ji-Xin Cheng)教授团队在《PhotoniX》上发表了一项创新研究。他们开发了一种基于光纤激光器的受激拉曼光热(Stimulated Raman Photothermal, SRP)显微镜。这项技术巧妙地绕开了传统SRS的噪声问题，并彻底解放了样品空间，为构建一个高性能、用户友好的化学成像平台提供了全新的解决方案。

关键技术方法

研究人员构建了一套基于皮秒可调谐光纤激光器的SRP显微镜系统。该系统利用光纤激光器产生同步的泵浦光和斯托克斯光，并引入第三束连续波(CW)探测光。当泵浦光和斯托克斯光在样品中发生SRS过程时，能量被分子吸收并转化为热量，形成热透镜效应。探测光穿过这个热透镜时，其远场分布会发生改变，通过测量这种变化即可实现高灵敏度的化学成像。该研究利用成年Long-Evans大鼠的脑组织切片作为样本，通过尿素溶液进行组织透明化处理，以验证系统在厚组织中的成像能力。

研究结果

光纤激光SRP显微镜的设计与性能

研究团队设计了一套倒置显微镜构型的SRP系统。其核心创新在于，利用SRP技术对探测光进行检测，而非直接检测SRS信号。这种设计使得系统对泵浦光和斯托克斯光的激光噪声不敏感，从而能够兼容噪声较大的光纤激光器。同时，由于SRP信号来源于热效应，其收集不再依赖高NA聚光镜。因此，研究人员在系统顶部使用了低NA、长工作距离的空气聚光镜，实现了28毫米的样品空间，使得多孔板、培养皿等开放式样品能够轻松成像。

通过热透镜效应模拟，研究人员确定了在二甲基亚砜(DMSO)中测量C-H键时，SRP信号的最大对比度出现在NA为0.32时，这远低于传统SRS的要求。性能测试表明，该系统对DMSO的C-H键检测限(Limit of Detection, LOD)达到11.13 mM，信噪比(SNR)比光纤激光SRS提升了约105倍。同时，系统保持了高空间分辨率，横向分辨率达到240纳米，轴向分辨率为0.82微米。

SRP在低NA条件下保持光谱保真度

为了验证SRP在低NA收集条件下的成像质量，研究人员比较了SRP和自平衡检测SRS对500纳米聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate, PMMA)微球的成像效果。结果显示，SRP图像清晰锐利，而SRS图像则出现模糊和伪影。更重要的是，SRP测得的光谱与PMMA的自发拉曼光谱高度吻合，而SRS的光谱则发生了严重畸变。这证明了SRP技术能够在低NA、长工作距离条件下，完美地保持化学成像的光谱保真度。

SRP在含水环境中成像细胞组成与动态

利用倒置构型的优势，研究人员成功对磷酸盐缓冲液(PBS)中培养的活细胞进行了无接触成像。通过高光谱SRP成像和最小绝对收缩和选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO)分析，他们清晰地绘制了T24膀胱癌细胞中胆固醇、蛋白质、脂质和细胞核的化学分布图。此外，系统还以每秒1帧的速度，实时捕捉到了活细胞中脂质的运动轨迹，展示了其在研究细胞动态过程中的强大能力。

利用热增强介质实现高灵敏代谢成像

研究人员发现，将生物样品浸入甘油或尿素等热增强介质中，可以显著提升SRP的成像对比度。利用这一特性，他们成功地对氘代油酸(Oleic Acid-d₃₄, OA-d₃₄)处理的T24细胞进行了高灵敏成像，清晰地揭示了细胞质和细胞膜上的细微结构。通过同时成像C-D键(2105 cm^-1)和C-H键(2930 cm^-1)，他们直观地展示了新合成脂质在细胞内的分布，为单细胞代谢研究提供了有力工具。

利用组织透明化实现大鼠脑组织的体积SRP组织学成像

为了展示系统在厚组织成像中的潜力，研究人员对尿素透明化处理的大鼠脑组织切片进行了体积SRP成像。尿素不仅作为组织透明剂增加了成像深度，其低热容特性也进一步增强了SRP信号。通过单色、双色和高光谱成像模式，系统清晰地揭示了大脑皮层中轴突、树突等精细结构，以及不同脑区细胞密度的差异，成像深度超过200微米。这证明了SRP技术在无标记、三维组织病理学诊断中的巨大应用价值。

研究结论与意义

这项研究成功开发了一种基于光纤激光器的受激拉曼光热(SRP)显微镜，它巧妙地解决了传统SRS显微镜在激光源和样品兼容性上的两大核心难题。该系统不仅实现了比光纤激光SRS高两个数量级的信噪比提升，还通过低NA、长工作距离的光学设计，将样品空间从毫米级扩展到厘米级，极大地拓宽了其应用范围。

该技术的成功，标志着无标记化学成像技术向便携化、用户友好化迈出了关键一步。它能够轻松兼容多孔板、活细胞培养皿等标准实验耗材，为高通量药物筛选、活细胞动态研究提供了强大的平台。同时，结合组织透明化技术，它能够对厚组织进行高分辨率的三维化学成像，为神经科学研究和临床病理诊断开辟了新的途径。这项研究为构建一个真正“走进实验室、走向临床”的化学成像平台奠定了坚实的基础。