棉花黑根腐病菌伯克利霉菌两株分离株的高质量基因组从头组装与比较基因组学分析

《Australasian Plant Pathology》：De Novo long-read assembly and annotation for genomes of two isolates of Berkeleyomyces rouxiae

本刊推荐：为解决棉花黑根腐病缺乏高质量基因组参考的瓶颈问题，研究人员对致病性差异显著的Berkeleyomyces rouxiae两分离株(22BRR77/RVB4.1)开展PacBio长读长测序与注释研究。成功获得N50达3.1 Mbp/2.8 Mbp的染色体级别基因组，首次解析该物种8 bp型端粒重复序列(CCCTAAAA)及MAT1-1/ MAT1-2交配型位点结构，通过多基因组比较揭示3个易位区域与重复序列富集的相关性。该研究为病原菌群体进化及致病机制研究提供了关键资源。

　　

在澳大利亚的广袤棉田中，一种名为黑根腐病的土传病害正悄然成为制约棉花生产的重大障碍。受感染的棉苗根部出现特征性黑化、生长停滞，尤其在低温播种季节危害加剧，最终导致严重减产。这场"黑色危机"的元凶，是子囊菌门的一种广宿主病原菌——伯克利霉菌（Berkeleyomyces rouxiae）。尽管该病原菌早在1989年就已入侵澳大利亚棉田，且现已扩散至所有植棉区，科学界对其基因组层面的认知却长期处于空白状态。此前NCBI数据库中仅存5个该属基因组，且最完整的伯克利霉菌（Berkeleyomyces basicola）基因组N50值也仅为368 Kbp，难以支撑深入的分子机制研究。

为破解这一困境，研究人员在《Australasian Plant Pathology》发表了突破性研究，通过对两株棉花源伯克利霉菌分离株进行三代测序，成功构建了高质量基因组图谱。这两株菌株（22BRR77和RVB4.1）虽同源却表现出迥异的致病性：22BRR77能引发植株矮化、茎部病斑和叶片萎蔫等严重症状，而RVB4.1仅导致轻微根部变色。这种致病性差异使其成为理想的研究模型。

研究团队采用PacBio HiFi长读长测序技术，分别获得1.38百万和1.58百万条中位数长度超过15 Kbp的高质量 reads。运用MitoHiFi软件组装出长度约110 Kbp的线粒体基因组后，通过hifiasm进行核基因组组装，并利用BUSCO评估显示基因组完整性达97.7%以上。通过RepeatModeler/RepeatMasker分析重复序列，结合RNA-seq数据验证转录活性，采用nucmer进行共线性分析，并使用BRAKER3进行基因结构注释。特别值得关注的是，研究还基于298个保守基因构建了Ceratocystidaceae科的系统发育树，确认菌株分类地位。

基因组组装质量评估

研究显示，22BRR77和RVB4.1的核基因组大小分别为33.3 Mbp和30.8 Mbp，N50值达到3.1 Mbp和2.8 Mbp，较既往基因组提升近10倍。两个组装均包含10条染色体级别的大 contigs，这些 contigs 显示出极高的读段映射质量（Phred质量分数>57）。通过seqtk telo分析，首次发现该物种端粒重复序列为独特的8 bp单元CCC^TAAAA，与传统子囊菌的6 bp型CCCTAA序列显著不同。在22BRR77的10条大contigs中，7条检测到端粒序列，RVB4.1中则达9条，暗示这些contigs可能代表完整染色体。

重复序列与三维基因组特征

重复序列分析揭示RVB4.1和22BRR77基因组的重复序列比例分别为25%和31%，主要以Gypsy/DIRS1类LTR反转录转座子和未分类LINE元件为主。RNA-seq数据证实这些重复区域具有高转录活性。共线性分析显示两基因组存在三大结构变异区域，其断点与重复序列富集区高度重合。与伯克利霉菌（Berkeleyomyces basicola）参考基因组的比较进一步证实这些区域在种间同样缺乏共线性，提示可能是真实存在的染色体易位或难以组装的复杂区域。

交配型位点解析

通过同源比对，研究成功鉴定出两菌株的交配型位点（MAT locus）：RVB4.1携带MAT1-1 idiomorph，包含MAT1-1-1和MAT1-1-2基因；而强致病菌株22BRR77具有MAT1-2 idiomorph，含MAT1-2-1和MAT1-2-7基因。两个idiomorph长度分别为5 Kbp和4.5 Kbp，两侧均 flanked by 保守的SLA2基因和一个功能未知基因，该结构与伯克利霉菌（Berkeleyomyces basicola）中报道一致。

系统发育定位确认

基于298个单拷贝保守基因构建的最大似然树（模型JTT+I+G4+F）清晰地将两菌株聚类于伯克利霉菌（Berkeleyomyces rouxiae）分支，与来自蚕豆、大麻和莴苣的该物种菌株紧密相邻。系统树同时提示GenBank中两个标注为Ceratocystis adiposa（CBS13634）和Thielaviopsis populi（CMW26388）的基因组可能存在属级分类错误，需进一步复核。

该研究首次提供了伯克利霉菌（Berkeleyomyces rouxiae）的参考级别基因组，不仅为理解该病原菌的基因组进化、致病机制和群体遗传学奠定基础，其揭示的非典型端粒结构更为真菌染色体生物学研究提供了新线索。研究中发现的结构变异区域可能与病原菌宿主适应性密切相关，而交配型位点的精确注释则为有性生殖研究提供分子靶点。这些高质量基因组数据将显著提升我们对黑根腐病病原生物学特性的认知，为开发新型防控策略提供理论依据。