双端驱动：G与TGS结构域介导水稻OsYchF1-OsGAP1弱相互作用复合体的形成机制

《Botanical Studies》：From biophysical interaction to structural modeling: bi-terminal G and TGS domains drive rice OsYchF1-OsGAP1 complex formation

为解决水稻非经典G蛋白OsYchF1如何锚定其激活蛋白OsGAP1这一关键科学问题，研究人员开展了“从生物物理相互作用到结构建模”的主题研究。研究通过酵母双杂交和等温滴定量热法(ITC)证实，OsYchF1通过其N端G结构域和C端TGS结构域与OsGAP1结合，而插入的螺旋结构域则产生空间位阻。研究还发现，尽管AlphaFold2未能准确预测该弱相互作用复合体(KD=102.6±11.7μM)的结构，但ClusPro蛋白对接算法成功生成了与实验证据高度吻合的模型，为研究弱蛋白-蛋白相互作用提供了新策略。

　　

在植物应对环境胁迫的复杂信号网络中，G蛋白扮演着至关重要的“分子开关”角色。其中，水稻中的非经典G蛋白OsYchF1及其激活蛋白C2结构域蛋白OsGAP1，共同构成了一个调控水稻抗逆性的关键模块。尽管已知OsGAP1能够结合并加速OsYchF1的GTPase和ATPase酶活性，但OsYchF1究竟如何“抓住”OsGAP1，这一分子层面的“握手”细节却一直是个谜。更棘手的是，这种相互作用非常微弱且短暂，导致科学家们一直无法通过共结晶技术获得其复合体结构，从而限制了对其功能机制的深入理解。

为了揭开这一谜团，福建农林大学生命科学学院植物功能生物学福建省重点实验室的苗锐团队在《Botanical Studies》上发表了一项研究。他们巧妙地结合了生物物理实验和人工智能结构预测工具，不仅阐明了OsYchF1与OsGAP1相互作用的分子基础，还意外地发现，在预测弱蛋白相互作用方面，传统的蛋白对接算法ClusPro表现优于大名鼎鼎的AlphaFold2。

主要技术方法

本研究主要运用了酵母双杂交(Y2H)和等温滴定量热法(ITC)来验证蛋白间的相互作用及测定结合亲和力；通过NTPase活性测定实验评估了OsGAP1对OsYchF1酶活性的促进作用；并利用AlphaFold2和ClusPro 2.0两种算法对OsYchF1-OsGAP1复合体结构进行了预测和比较。

研究结果

OsYchF1 G和TGS结构域对其与OsGAP1的相互作用至关重要

为了探究OsYchF1的哪个区域负责与OsGAP1结合，研究人员首先进行了酵母双杂交实验。他们构建了OsYchF1的全长蛋白及其截短体（包括N端G结构域、插入的螺旋结构域、C端TGS结构域以及不含TGS结构域的No TGS结构域），分别与OsGAP1进行配对。结果发现，全长OsYchF1与OsGAP1的组合在筛选培养基上无法生长，表明在酵母系统中，这两个蛋白的相互作用可能受到了阻碍。然而，当单独使用G结构域或TGS结构域时，酵母菌均能正常生长，证明这两个结构域都能独立结合OsGAP1。有趣的是，包含G结构域和螺旋结构域的No TGS结构域也无法与OsGAP1结合，这暗示插入的螺旋结构域可能对G结构域的结合产生了空间位阻。

OsYchF1-OsGAP1复合体的热力学分析

为了在体外精确量化这种相互作用，研究人员利用等温滴定量热法(ITC)进行了热力学分析。结果显示，单独的G结构域和TGS结构域都能以较高的亲和力结合OsGAP1，其解离常数(K_D)分别为11.9±6.7μM和5.1±2.3μM。然而，包含G结构域和螺旋结构域的No TGS结构域与OsGAP1的结合亲和力极低(K_D=98.7±24.1μM)，这再次证实了螺旋结构域的阻碍作用。最令人意外的是，全长OsYchF1与OsGAP1的结合亲和力非常弱(K_D=102.6±11.7μM)，与No TGS结构域的结果相似。热力学参数分析表明，全长蛋白的结合主要由熵驱动，这意味着结合过程伴随着水分子从蛋白界面释放到溶剂中，是一种典型的疏水相互作用。这些数据共同说明，OsYchF1的G和TGS结构域是结合OsGAP1的关键，而螺旋结构域的存在则通过空间位阻和诱导构象变化，使得全长蛋白的结合变得非常微弱和动态。

OsGAP1促进OsYchF1酶活性

研究人员进一步测定了OsYchF1及其截短体的NTPase（核苷三磷酸酶）活性。结果显示，OsGAP1能够显著促进全长OsYchF1以及No TGS结构域的GTPase和ATPase活性。尽管No TGS结构域在结合实验中表现出极弱的亲和力，但它仍然保留了被OsGAP1激活的能力，这表明OsGAP1可能通过一种瞬时的、动态的相互作用来发挥其激活功能。

AlphaFold2未能准确预测OsYchF1-OsGAP1复合体的结构模型

鉴于该复合体难以结晶，研究人员尝试利用人工智能工具AlphaFold2来预测其三维结构。尽管AlphaFold2预测的模型在结构质量评估指标（如pLDDT）上得分很高，但其预测结果与已知的实验证据存在矛盾。例如，模型预测的结合位点与之前通过定点突变实验确定的OsGAP1上的关键结合簇（cluster 1和cluster 3）相距甚远。这表明，对于像OsYchF1-OsGAP1这样亲和力极低的弱相互作用复合体，AlphaFold2可能无法准确捕捉其动态的构象变化。

ClusPro生成了高度准确的OsYchF1-OsGAP1复合体结构模型

作为对比，研究人员使用了基于模板的蛋白对接算法ClusPro。令人惊喜的是，ClusPro生成的模型与实验证据高度吻合。模型显示，OsYchF1的TGS结构域中的关键氨基酸Glu-354与OsGAP1上的Thr-58形成氢键；G结构域中的Glu-71和Asp-74分别与OsGAP1上的Lys-41和Lys-39形成盐桥；此外，OsGAP1上的疏水氨基酸Phe-78和Ile-79则嵌入到OsYchF1的疏水口袋中。这些相互作用模式完美地解释了ITC实验中观察到的由疏水作用驱动的结合特性，并且与之前报道的定点突变结果完全一致。

结论与讨论

本研究通过严谨的生物物理实验，首次揭示了水稻非经典G蛋白OsYchF1通过其N端G结构域和C端TGS结构域“双端驱动”地结合其激活蛋白OsGAP1，而中间的螺旋结构域则扮演了“调节者”的角色，通过空间位阻使得全长蛋白的结合变得微弱而动态。这种弱相互作用特性使得该复合体难以结晶，从而阻碍了对其分子机制的深入理解。

更重要的是，本研究对当前炙手可热的AI结构预测工具AlphaFold2在弱蛋白相互作用领域的适用性提出了重要警示。研究发现，尽管AlphaFold2在预测高亲和力蛋白复合体方面表现出色，但对于OsYchF1-OsGAP1这种典型的弱相互作用复合体，其预测结果与实验证据不符。相反，传统的蛋白对接算法ClusPro则成功生成了与实验数据高度吻合的模型。

这一发现具有重要的方法论意义。它提示我们，在研究难以结晶的弱蛋白相互作用复合体时，不能盲目依赖单一的AI预测工具。将传统的蛋白对接算法与湿实验证据（如突变分析、热力学数据）相结合，可能是一种更可靠、更有效的策略。这项研究不仅阐明了OsYchF1-OsGAP1模块的相互作用机制，也为未来研究其他弱蛋白相互作用提供了宝贵的范式和思路。