Heyndrickxia coagulans 9FT27 产新型生物表面活性剂 fengycin 的分离鉴定及其对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

《AMB Express》：Characterization of a newly isolated biosurfactant fengycin produced by Heyndrickxia coagulans strain

本研究针对抗生素耐药性日益严峻的全球性问题，从马皮肤分离的 Heyndrickxia coagulans 9FT27 中成功分离并鉴定出一种新型生物表面活性剂 fengycin。该物质在 0.2-15 mg/mL 浓度范围内能显著抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus CCM 4223）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生物膜形成，并显著下调与生物膜形成相关的 icaADB 操纵子、srtA、gyrB 和 clfB 基因的表达。该研究为开发新型抗生物膜感染治疗策略提供了新的候选物质。

　　

在人类和兽医医学领域，抗生素耐药性已成为一个日益严峻的全球性挑战。随着传统抗生素的效力逐渐减弱，寻找安全、有效的替代品迫在眉睫。生物表面活性剂（Biosurfactants, BSs）作为一种由微生物产生的天然产物，因其低毒性、高生物降解性以及独特的抗菌机制，被视为对抗病原微生物的潜在利器。其中，脂肽类生物表面活性剂 fengycin 因其广谱的抗菌活性而备受关注。然而，fengycin 的生产通常局限于芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的某些菌株，其来源有待进一步拓展。

近日，来自斯洛伐克科希策兽医医药大学的研究团队在《AMB Express》上发表了一项突破性研究。他们首次从一株名为 Heyndrickxia coagulans 9FT27 的菌株中成功分离并鉴定出 fengycin，并证实该物质能有效抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）的生物膜形成，为开发新型抗生物膜感染治疗策略提供了新的候选物质。

为了回答 Heyndrickxia coagulans 9FT27 是否产 fengycin 及其抗生物膜活性如何这两个核心问题，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先从健康马皮肤分离并鉴定出 H. coagulans 9FT27 菌株，通过 PCR 筛选其是否携带 fengycin 合成基因 fenD。随后，利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UHPLC-DAD）、核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）等技术对提取的生物表面活性剂进行结构鉴定。在功能验证方面，他们采用结晶紫染色法评估了该物质对金黄色葡萄球菌参考菌株（S. aureus CCM 4223）和临床分离的 MRSA 菌株生物膜形成的抑制作用，并通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术分析了其对生物膜相关基因表达的影响。

主要技术方法

本研究首先从健康马皮肤分离并鉴定出 Heyndrickxia coagulans 9FT27 菌株。通过 PCR 筛选其是否携带 fengycin 合成基因 fenD。利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UHPLC-DAD）、核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）等技术对提取的生物表面活性剂进行结构鉴定。采用结晶紫染色法评估其对金黄色葡萄球菌参考菌株（S. aureus CCM 4223）和临床分离的 MRSA 菌株生物膜形成的抑制作用。通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术分析其对生物膜相关基因表达的影响。

Identification of genes responsible for biosynthesis of biosurfactant in Heyndrickxia coagulans 9FT27

研究人员首先通过 PCR 筛选，在 H. coagulans 9FT27 的基因组中成功检测到 fengycin 合成基因 fenD 的存在。系统发育分析显示，该菌株的 fenD 基因与其他芽孢杆菌属菌株的 fenD 基因同源性在 27.63% 到 28.82% 之间，表明其具有合成 fengycin 的遗传潜力。

Ultrahigh-performance liquid chromatography

为了进一步确认 fengycin 的产生，研究人员利用 UHPLC-DAD 技术对提取物进行了分析。结果显示，H. coagulans 9FT27 产生的脂肽提取物在 2.6 到 7.7 分钟之间出现了一组色谱峰，其保留时间与 fengycin 标准品高度相似，初步证实了 fengycin 的存在。

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

核磁共振分析为 fengycin 的结构提供了更深入的证据。1H NMR 谱图显示，在 0.8-1.7 ppm 范围内存在饱和脂肪链质子的自旋系统，在 4.20 ppm 处观察到一个多重峰，在 2.01 ppm 处观察到一个三重峰，这些信号均归属于脂肪酸链。此外，在 2.5-4.5 ppm 范围内观察到的自旋系统则对应于氨基酸链的质子。这些特征信号与文献报道的 fengycin 结构一致，进一步支持了该物质为脂肽类 fengycin 的结论。

MALDI-TOF/MS analysis

质谱分析是鉴定分子量的金标准。MALDI-TOF/MS 分析结果显示，H. coagulans 9FT27 产生的生物表面活性剂提取物与商业 fengycin 标准品的质谱峰高度吻合，除了 1530 和 1544 两个峰外，其余所有峰均被检测到。这一结果最终确凿地证实了 H. coagulans 9FT27 能够产生 fengycin。

The effect of BS 9FT27 on S. aureus CCM 4223 and MRSA biofilm formation

在功能验证方面，研究人员评估了该 fengycin 提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用。结晶紫染色结果显示，在 0.2 到 15 mg/mL 的浓度范围内，该物质能显著抑制 S. aureus CCM 4223 和 MRSA 的生物膜形成。其中，在 0.9 到 15 mg/mL 的高浓度下，对 S. aureus CCM 4223 的生物膜抑制率高达 92% 到 97%，对 MRSA 的抑制率也达到了 60% 到 75%。即使在低至 0.1 mg/mL 的浓度下，仍能观察到显著的抑制作用。

Analysis of the qRT-PCR results

为了探究其作用机制，研究人员通过 qRT-PCR 分析了 fengycin 对生物膜相关基因表达的影响。结果显示，该物质能显著下调 icaA、icaB 和 icaD 基因的表达，这三个基因是编码胞间多糖粘附素（PIA）的 icaADBC 操纵子的关键组成部分，而 PIA 是金黄色葡萄球菌生物膜基质的主要成分。此外，编码分选酶 A（sortase A, srtA）的基因表达也被显著下调，该酶负责将表面蛋白锚定在细胞壁上，对细菌的粘附能力至关重要。编码聚集因子 B（clumping factor B, clfB）的基因表达同样受到抑制，该蛋白是金黄色葡萄球菌定植上皮细胞的关键毒力因子。值得注意的是，编码 DNA 旋转酶 B 亚基的 gyrB 基因表达也被显著下调，该酶是细菌 DNA 复制和修复的关键酶，其表达下调可能进一步削弱了细菌的生存和增殖能力。

研究结论与讨论

本研究首次报道了 Heyndrickxia coagulans 9FT27 能够产生脂肽类生物表面活性剂 fengycin。通过 UHPLC-DAD、NMR 和 MALDI-TOF/MS 等多种技术手段，研究人员确凿地证实了该物质的结构。更重要的是，该研究揭示了 fengycin 具有强大的抗生物膜活性，能有效抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生物膜形成。

其作用机制并非简单的杀菌，而是通过多靶点调控，显著下调了与生物膜形成密切相关的多个关键基因的表达，包括 icaADB 操纵子、srtA、clfB 和 gyrB。这种多基因调控模式表明，fengycin 可能通过干扰细菌的粘附、胞外基质合成以及细胞分裂等多个环节，从而有效瓦解生物膜结构。

这项研究不仅拓展了 fengycin 的生产菌株来源，更重要的是，为开发新型抗生物膜感染治疗策略提供了强有力的候选物质。鉴于生物膜是导致慢性感染和抗生素耐药性的重要原因，该发现对于应对日益严峻的抗生素耐药性挑战具有重要的科学意义和应用前景。