整合单细胞与bulk RNA测序构建乳腺癌铜死亡相关基因预后标志物

《Hormones & Cancer》：Integrating single-cell and bulk RNA sequencing data establishes a cuproptosis-related gene predictive signature in breast cancer

本研究针对乳腺癌分子异质性强、预后预测标志物不足的临床挑战，通过整合TCGA和GEO多组学数据，系统分析了铜死亡相关基因（CRGs）的预后价值。研究人员利用WGCNA和LASSO回归构建了四基因（CCDC24、TMEM65、XPOT、NUDCD1）预后标志物，成功将患者分为高风险和低风险组，并发现高风险组总体生存率更差、TP53突变频率更高、肿瘤微环境呈现免疫抑制特征。该模型为乳腺癌个体化风险分层和治疗决策提供了新工具。

　　

乳腺癌（BRCA）作为全球女性中最常见的恶性肿瘤，持续位居癌症相关死亡原因的首位。尽管早期检测和靶向治疗取得了显著进展，但其显著的分子异质性和治疗耐药性的出现仍然对临床管理构成严峻挑战。近年来，过渡金属稳态在肿瘤生物学中的作用日益受到关注，特别是铜失调的致癌潜力。铜作为必需的微量元素，参与线粒体呼吸、氧化还原平衡和铁代谢等关键生理过程。在生理条件下，其细胞内水平受到严格调控；而偏离正常范围则与神经退行性疾病和血液系统疾病等多种病理状况相关。值得注意的是，过量的铜积累会触发一种新定义的调节性细胞死亡形式——铜死亡（cuproptosis），其特征是线粒体铜超载、脂酰化三羧酸（TCA）循环蛋白聚集、铁硫（Fe-S）簇蛋白丢失、蛋白毒性应激，最终导致细胞死亡。

基因组范围的CRISPR-Cas9筛选已经描绘了铜死亡调控的核心分子框架，确定了七个正调节因子（FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1和PDHB）和三个抑制因子（MTF1、GLS和CDKN2A）。临床观察显示，铜水平升高与多种癌症类型的不良预后相关，而在临床前模型中诱导铜死亡显示出肿瘤抑制作用，支持其作为预后生物标志物和治疗靶点的双重潜力。然而，铜死亡相关基因（CRGs）在乳腺癌进展中的功能相关性仍 largely unexplored。特别是，CRG表达如何影响肿瘤行为、塑造肿瘤微环境（TME）并与临床结局相关，尚未得到系统研究。

为了填补这一知识空白，彭荣荣等人开展了一项综合性研究，通过整合TCGA和GEO队列的多组学数据，系统评估了CRGs在乳腺癌中的预后意义。研究人员采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别关键模块，并结合机器学习算法构建预后模型。研究团队进一步通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术揭示了标志基因在肿瘤微环境不同细胞群体中的异质性表达模式，为理解其生物学功能提供了细胞层面的见解。

研究主要关键技术方法包括：从TCGA数据库获取1059例乳腺癌样本和99例正常组织的基因表达与临床数据，使用GSE20685数据集进行外部验证；通过WGCNA构建基因共表达网络识别与临床性状相关的模块；采用LASSO Cox回归分析筛选预后相关CRGs并建立风险评分模型；利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）、CIBERSORT和ESTIMATE算法评估免疫细胞浸润和TME特征；基于GEO数据库的scRNA-seq数据（GSE176078）分析关键基因在肿瘤组织不同细胞类型中的表达分布。

研究结果揭示了CRGs在乳腺癌中的显著表达失调和基因组改变。与正常组织相比，DLD、LIAS、PDHA1、FDX1、LIPT1、MTF1和GLS在肿瘤组织中显著上调，而CDKN2A和PDHB则下调。不同分子亚型间CRGs表达存在明显异质性，三阴性乳腺癌（TNBC）中六个CRGs表达显著高于非TNBC组。

通过WGCNA分析，研究人员成功构建了基因共表达网络，确定了与CRGs显著相关的模块（粉色、黄色和午夜蓝色模块）。应用严格筛选标准（模块成员度MM>0.6，基因显著性GS>0.4）鉴定出108个候选枢纽基因，这些基因在模块内具有高连接性且与铜死亡表型强相关。

预后模型的构建过程中，单变量Cox回归分析识别出23个与总生存期显著相关的基因。通过LASSO回归进一步筛选出四个核心预后基因：CCDC24、TMEM65、XPOT和NUDCD1，建立了风险评分模型。风险评分公式为：风险评分=(-0.051×CCDC24)+(6.355×10^-5×TMEM65)+(0.056×XPOT)+(0.115×NUDCD1)。

该模型在训练集和验证集中均显示出良好的预后分层能力，低风险组患者总生存期显著优于高风险组。时间依赖性ROC曲线分析显示，验证队列中1年、3年和5年生存预测的AUC值分别为0.738、0.655和0.641，表明模型具有较好的预测准确性。

多变量Cox回归分析显示，该标志物在调整年龄、分期、免疫亚型和TNBC状态后，显示出独立的预后趋势（P=0.055）。风险评分与临床病理特征的相关分析发现，年龄小于60岁、基底样亚型、免疫C4型和TNBC患者的风险评分显著较高。

功能富集分析显示，108个CRG相关基因主要富集于染色体分离和细胞周期调控通路。基因集变异分析（GSVA）揭示了风险组间的代谢特征差异：低风险组富集于外源性代谢和脂肪生成通路，而高风险组则显示精子发生和mTORC1信号通路激活。

基因组分析发现高风险组具有更高的TP53突变频率和拷贝数变异负荷。体细胞突变分析显示，TP53和PIK3CA是队列中最常突变的基因，高风险组缺失事件和拷贝数改变频率显著高于低风险组。

肿瘤微环境分析揭示了风险分组与免疫特征的显著关联。高风险组基质评分较低，免疫细胞组成呈现抑制性特征：CD56暗淡自然杀伤（NK）细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC）浸润减少，而活化的CD4⁺T细胞和树突状细胞（DC）增多。

药物敏感性分析表明，高风险患者对AZD2014、GNE-317和UMI-77等多种药物的敏感性显著降低，提示CRG风险评分可能作为治疗反应的预测生物标志物。

单细胞转录组分析进一步揭示了肿瘤微环境的细胞异质性和CRGs的细胞类型特异性表达模式。UMAP可视化显示了乳腺癌组织中的主要细胞类型分布，包括恶性上皮细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞和其他基质成分。关键CRGs（CCDC24、TMEM65、XPOT和NUDCD1）在不同细胞类型中呈现异质性表达：CCDC24和XPOT在上皮细胞簇中富集，而TMEM65和NUDCD1在基质和免疫区室中分布更广。

研究结论强调，铜死亡在乳腺癌中扮演着重要的调控角色，其相关基因标志物不仅提供了可靠的预后分层工具，还为理解肿瘤进展、免疫调节和治疗反应提供了新的视角。高风险患者可能受益于强化治疗或免疫调节策略，而低风险个体则可考虑降级治疗。该研究的局限性包括基于回顾性数据、缺乏前瞻性验证，以及观察到的CRG表达与免疫浸润之间的关联性需要进一步机制研究验证。未来研究应聚焦于CRGs的功能验证和通过前瞻性试验进行临床转化。

这项研究首次系统性地将铜死亡相关基因与乳腺癌预后联系起来，通过整合多组学数据和单细胞技术，为乳腺癌精准医疗提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。该CRG-based风险标志物不仅有助于识别高危患者，还为开发针对铜死亡通路的新型治疗策略奠定了理论基础，对改善乳腺癌患者临床管理具有重要意义。