单细胞RNA测序揭示骨肉瘤微环境中NFATc1介导的血管平滑肌细胞成骨转化的调控机制

《Hormones & Cancer》：Single-cell RNA sequencing reveals NFATc1-mediated regulatory mechanisms of vascular smooth muscle cell osteogenic transformation in the osteosarcoma microenvironment

本研究通过单细胞RNA测序技术，深入解析了骨肉瘤微环境中血管平滑肌细胞(VSMCs)的成骨转化机制。研究发现NFATc1在VSMCs中特异性高表达，并与SERGEF、APOE、CCS等基因形成共表达网络，揭示了细胞骨架重塑、脂质代谢和铜稳态在VSMC成骨重编程中的协同作用，为靶向治疗提供了新思路。

　　

在骨骼恶性肿瘤研究领域，骨肉瘤作为最常见的原发性骨肿瘤，尤其好发于骨骼快速生长的青少年时期，其治疗困境始终是临床医生和科研人员关注的焦点。尽管现代医学已采用手术联合放化疗的综合治疗方案，但一旦发生转移，患者的五年生存率仍徘徊在20%-30%的低水平。这一严峻现实促使科学家将目光投向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）这一复杂生态系统，试图从中寻找新的治疗突破口。

肿瘤微环境如同一个精密的社交网络，其中恶性细胞与多种基质细胞（包括成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞等）通过分泌因子和细胞外囊泡进行密切交流。在这个网络中，血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）扮演着特殊而关键的角色——它们不仅参与肿瘤血管的重塑以支持肿瘤生长，更令人惊讶的是，这些细胞在特定条件下会表现出成骨特性，这种"身份转变"与肿瘤的侵袭性增强和不良预后密切相关。然而，驱动VSMCs向成骨细胞方向转化的分子开关究竟是谁？这一科学问题成为了本研究探索的起点。

在众多候选调控因子中，活化T细胞核因子c1（Nuclear Factor of Activated T Cells c1, NFATc1）引起了研究人员的特别关注。NFATc1最初在免疫细胞活化中被发现，后续研究表明该转录因子在骨骼生物学中发挥着核心作用，参与骨与软骨发育、破骨细胞功能以及病理性钙化过程。特别是在钙信号传导、骨基质合成和细胞命运决定等关键生物学过程中，NFATc1都扮演着"指挥家"的角色。但令人困惑的是，在骨肉瘤这一特殊场景下，NFATc1如何调控VSMCs的成骨转化，其具体作用机制仍是一片未知的领域。

传统的研究方法如批量RNA测序，只能提供细胞群体的平均基因表达谱，无法揭示细胞异质性这一重要特征。而单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术的出现，使科研人员能够以单个细胞的分辨率解析复杂组织的转录组 landscape，发现那些在群体水平上被掩盖的稀有细胞状态和连续过渡状态。正是基于这一技术优势，易雪娇等研究人员决定采用scRNA-seq技术，结合单细胞外泌体RNA分析，对骨肉瘤微环境进行全面测绘，重点探究NFATc1为中心的通路是否在指导VSMCs的成骨转化轨迹中发挥关键作用。

研究人员通过整合细胞多样性、转录程序和基因水平相关性等多维度数据，旨在阐明NFATc1在骨肉瘤血管病理中的贡献，并识别潜在的治疗靶点。这项创新性研究最终发表在《Discover Oncology》期刊上，为骨肉瘤的精准治疗提供了新的理论依据。

关键技术方法包括：使用10x Genomics Chromium平台对新鲜骨肉瘤组织进行单细胞RNA测序；通过机械法和酶解法获得单细胞悬液，流式细胞术筛选活性大于85%的细胞；采用Harmony算法进行批次效应校正；基于Seurat软件进行主成分分析（PCA）、UMAP/t-SNE降维可视化以及Louvain聚类分析；通过CellMarker和PanglaoDB数据库进行细胞类型注释；利用Pearson相关性分析构建NFATc1共表达网络；使用qRT-PCR对关键基因表达进行验证。

质量控制和预处理分析

研究人员首先对骨肉瘤单细胞外泌体RNA测序数据集进行了严格的质量评估。质量控制指标显示，每个细胞检测到的基因数（nFeature_RNA）主要分布在0-10,000范围内，总RNA计数（nCount_RNA）在0-150,000之间，线粒体基因百分比（percent.mt）集中在0%-25%，这些分布特征表明获得了高质量的单细胞文库。通过高度可变基因（Highly Variable Genes, HVGs）筛选程序，研究人员确定了2,000个对生物变异贡献最大的基因用于后续分析，为深入研究VSMCs成骨变化及相关外泌体调控机制奠定了可靠基础。

主成分分析和细胞聚类

主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）捕获了细胞间变异的主要轴。PC1主要由炎症和免疫相关转录本（如PLAUR、CYP1A1、CD14和IL1B）驱动，而PC2则强调细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）和成骨程序（包括SPARC、COL1A2、MAFB和MXRA8）。通过UMAP和t-SNE非线性映射，研究人员稳定地识别出九个转录簇（0-8）。功能注释显示，与NFATc1共表达的基因在Gene Ontology分析中富集于骨骼系统发育、细胞分化和凋亡等过程，KEGG通路分析则突出显示了经典Wnt、TGF-β和MAPK级联反应——这些通路都与成骨特化和基质重塑有已知关联。

基因表达谱和功能注释

亚群分析 delineated 九个转录不同的组，它们在UMAP上表现出特征性的空间分布模式。簇1和8富含肥大细胞基因（TPSB2、TPSAB1）；簇5和6上调纤维状胶原（COL1A1、COL1A2、COL3A1），与活跃的ECM合成和成骨重塑一致；簇7表达通常与骨吸收相关的基因（CTSK、ACP5）；簇2显示与免疫招募和迁移程序相关的趋化因子（CXCL5、CCL2）。这种细胞状态 constellation 为解释NFATc1相关信号（包括那些通过细胞外囊泡运输的信号）如何协调VSMCs向成骨表型进展提供了框架。

细胞类型识别和NFATc1表达特征

整合差异标记基因和参考资源，研究人员成功注释了骨肉瘤微环境中的九种主要细胞类型：炎症性髓系细胞、NK细胞、T细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、B细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞和肥大细胞。NFATc1在这些细胞类型中的分布并不均匀，小提琴图显示VSMCs具有最高的NFATc1水平，并且呈现出明显的双峰分布模式，暗示了内部异质性。相比之下，B细胞、成纤维细胞和炎症性髓系细胞表现出较低且较窄的分布。聚焦VSMCs区室，直方图/密度图显示，虽然许多细胞的NFATc1表达接近零，但一个离散的细胞群落在约1.5至2.5（任意单位）之间形成高表达层，表明存在与成骨重编程一致的激活状态。

NFATc1表达模式和共调控网络

在组织水平上，NFATc1表现出梯度表达 landscape，在单细胞图谱中具有局部峰值，归一化单位中最大值接近3.0。在VSMCs亚群中，高表达细胞形成空间邻域，值通常在1.0到2.0之间，暗示功能一致的VSMCs聚集在流形的相似区域。共表达图谱识别出与NFATc1密切相关的转录本，包括APOE、CCS、HSD17B12、UTS2和SERGEF。这些伙伴基因的功能——脂质处理、铜稳态和信号传导——与成骨转变期间预期的代谢和结构重编程相符。通过整合细胞身份、位置和NFATc1水平的三维视图，研究人员直观地展示了VSMCs亚群如何在肿瘤环境中协调成骨程序。

共表达调控网络和细胞类型特异性表达流

相关性分析 sharpened NFATc1中心网络的轮廓。SERGEF与NFATc1的相关性最强（r=0.673, p<0.001），与其在细胞骨架重塑和形态变化中的作用一致。代谢伙伴也很突出：APOE（r=0.463, p<0.01）指向脂质稳态，CCS（r=0.502, p<0.01）暗示铜运输和潜在的赖氨酰氧化酶依赖性胶原成熟。LARS（亮氨酰-tRNA合成酶；r=0.459, p<0.01）的信号表明，在表型改变期间，翻译控制可能伴随转录重编程。为了将这些基因水平的相关性与细胞分布联系起来，研究人员将NFATc1表达分为低、中、高三个层级，并构建了Sankey图。VSMCs独特地主要流向高层级，而B细胞、成纤维细胞和炎症性髓系细胞主要分布在低至中层级的区间内。这种模式论证了NFATc1在钙化和成骨重编程中的细胞类型特异性作用。

qRT-PCR验证

为了验证单细胞发现，研究人员使用人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMCs）系，并用骨肉瘤条件培养基（OS-CM）模拟肿瘤微环境。qRT-PCR结果证实，与标准培养条件下的对照VSMCs相比，OS-CM处理的VSMCs中NFATc1、SERGEF、APOE和CCS的mRNA水平显著升高（所有p<0.01），镜像了转录组对比。单细胞测量和qRT-PCR结果的一致性支持了观察到一个协调程序的观点，而非随机噪声或样品处理假象。

研究结论与讨论部分强调，单细胞RNA测序数据集明确指出了NFATc1在骨肉瘤微环境中的决定性富集，其中血管平滑肌细胞（VSMCs）在所有注释谱系中显示出最强的信号。NFATc1在VSMCs区室内的双峰分布将一个低表达多数群体与一个独特的高表达亚群分离开来。后者通过表达强度和邻域结构，似乎代表了处于成骨转变过程中的细胞，而非仅仅是激活的平滑肌状态。

共表达结构将细胞骨架 squarely 置于变化路径中。SERGEF与NFATc1的最强正相关性（r=0.673）符合其作为Rho家族GTPases的鸟嘌呤核苷酸交换因子的功能。代谢控制作为第二个同等突出的轴线出现。通过APOE（r=0.463）的相关性将脂质处理置于成骨程序中，并与脂质通量失衡有利于异位矿物沉积的证据相吻合。铜生物学通过CCS（铜伴侣蛋白超氧化物歧化酶）介入，其与NFATc1的相关性为r=0.502。NFATc1-CCS连接因此预测了在VSMC转变期间铜依赖性基质组装的调谐。

细胞状态图谱与这一观点一致。两个胶原表达簇（簇5和6）显示出高水平的COL1A1、COL1A2和COL3A1，标志着VSMCs谱系内的合成、基质产生表型。这些簇可能代表了沿成骨连续体的连续站点，增加的胶原输出伴随着向成骨细胞样命运的定向。相比之下，富含CTSK和ACP5的簇7携带更典型地与破骨细胞功能相关的骨吸收特征。基质产生和吸收在同一肿瘤微环境中的并列意味着正在进行重塑而非静态沉积。炎症成分也很明显：簇2表达CXCL5和CCL2，这些趋化因子已知能招募免疫细胞并刺激血管生成。在这种情况下，炎症信号、血管重塑和成骨重编程似乎是编织在一起的过程，而非孤立的线索。

治疗意义自然来自细胞类型偏斜。由于NFATc1在VSMCs中最显著，旨在抑制其活性或减弱关键伙伴的策略可能选择性地减少病理性钙化，同时最小化对邻近谱系的影响。SERGEF/Rho-GTPase轴提供了对表型改变所需的细胞骨架转变的影响力。通过APOE相关通路操纵脂质通量或通过CCS操纵铜处理可能会扰乱支持胶原生产和矿化的代谢支架。最后，细胞外囊泡作为肿瘤微环境内通信通道的观察到的角色指出，基于外泌体的递送抑制性RNAs或小分子是将治疗定位到血管区室的一种方式。

总之，数据将NFATc1置于VSMC程序的中心，该程序将转录开关、细胞骨架重塑和代谢重新配置耦合起来以驱动成骨转化。与SERGEF、APOE和CCS的特异性关联将该程序组织成可操作的模块——结构、脂质和铜——可以单独或组合地进行扰动。通过以单细胞分辨率 mapping 这些关系，该研究为机制实验提供了一个框架，并为治疗探索提供了一个简短的目标列表，最终目的是将异常矿化与支持骨肉瘤生长的血管 niche 解耦。