综述：血液蛋白质组学在细胞治疗定量生物标志物中的应用

本综述系统阐述了血液蛋白质组学技术在细胞治疗生物标志物研究中的最新进展。文章详细比较了质谱(MS)技术与亲和平台(Olink/SomaScan)的技术优势，重点介绍了在造血细胞移植(HCT)和CAR-T细胞治疗中已验证的生物标志物（如ST2、Reg3α、IL-6等），并探讨了机器学习(ML)和人工智能(AI)在生物标志物开发中的应用前景，为推进精准医疗提供重要参考。

当前方法和技术

血液蛋白质组学领域近年来取得显著技术进步，特别是在质谱(MS)技术和亲和平台方面。血浆作为最易获取的生物样本，因其蛋白质浓度动态范围跨越10个数量级而面临分析挑战。高丰度蛋白占血浆蛋白总量的99%，传统方法仅能可靠定量约300种蛋白质。

新型样本预处理技术突破了这一瓶颈。磁珠技术（如SP3方法）使用羧基化磁性颗粒捕获蛋白质，而Seer公司的Proteograph产品采用五种纳米颗粒组合，可从141例非小细胞肺癌患者血浆中鉴定超过2,000种蛋白质。更令人瞩目的是，使用优化后的质谱仪器，单个样本可识别超过3,100个蛋白质组，在技术评估中达到约4,500个蛋白质组的鉴定水平。在培养细胞上清液的分析中，甚至实现了10,000种蛋白质的鉴定，其中5,000种来自人类分泌蛋白。

PreOmics公司的ENRICHplus试剂盒可实现96样本并行处理，使用50μL血浆即可鉴定超过5,500个蛋白质组，每个样本成本约150美元。Mag-Net技术则采用强阴离子交换磁珠捕获细胞外囊泡(EVs)，同时减少高丰度血浆蛋白的富集，使用不足100μL血浆即可鉴定超过4,000个蛋白质组，每个样本磁珠成本低于1美元。

最经济高效的方法是酸沉淀技术。使用3.5%高氯酸处理3,199个COVID-19患者血浆样本，平均每个运行鉴定1,343种蛋白质，44个板间几乎无批次效应，每个样本成本仅2-3美分，为大规模生物标志物研究提供了极高性价比的解决方案。

基于质谱(MS)的方法

发现性全局蛋白质组学研究通常采用"自下而上"策略。样品经过蛋白质分离后，用胰蛋白酶消化成肽段，通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行分析。质谱仪首先检测肽段离子的质荷比(m/z)，称为MS扫描，然后选择特定离子进行碎裂，记录碎片离子的m/z，产生MS/MS谱图。现代质谱仪扫描速率达40-200Hz，分析时间长达两小时，单个实验可产生数百万张谱图。

轨道阱质谱仪是生物标志物发现研究的主力工具。混合型轨道阱仪器将轨道阱质量分析器与四极杆或离子阱结合，形成双功能质量分析器。三合一轨道阱仪器则耦合了轨道阱、四极杆和离子阱三种质量分析器。最新进展是将轨道阱与新型飞行时间(TOF)分析器Astral（不对称轨道无损分析器）结合，该分析器使用时空聚焦技术，质量分辨率达80,000，扫描速度200Hz，具有单离子检测灵敏度。升级版Astral Zoom通过硬件和软件改进，将采集速率提高至270Hz，分辨率达到100,000，能够分析TMTpro 32-plex多重标记样本。

离子淌度与飞行时间质谱联用技术也日益普及。布鲁克公司的timsUltra AIP是最新一代离子淌度飞行时间质谱仪，扫描速度达300Hz，质量分辨率60,000。

数据依赖采集(DDA)是传统的生物标志物发现策略，其选择前体离子基于相对强度，优先碎裂最丰富的离子。这种方法存在两个局限性：离子选择的随机性导致运行间重复性降低和数据缺失值频繁；低丰度离子常被忽略。

数据非依赖采集(DIA)通过系统碎裂预定m/z窗口内的所有离子，窗口宽度通常为2-20m/z。由于m/z窗口大小和循环时间在实验间保持一致，DIA提供高度重复的数据采集。所有窗口内的离子都经过碎裂和MS/MS分析，能够识别和定量更广泛的肽段，包括低丰度物种。DIA避免了选择偏差，提供更均匀的肽段表征，显著减少定量值的缺失。尽管DIA谱图因多个共洗脱肽段同时碎裂而高度复杂，但先进的计算工具通过解卷积谱图、匹配观察与预测的碎片离子以及重建洗脱曲线来解决这一复杂性。

现代蛋白质组学实验室通常以每天分析样本数(SPD)来表征方法通量，如12SPD、24SPD、48SPD甚至更高。使用更快扫描仪器，大规模研究变得更容易实现。例如，使用48SPD方法分析2,000个样本需约42天，而180SPD方法仅需11天。样本数量的增加将带来蛋白质鉴定数量的增加和统计分析效能的提高。

单细胞定量蛋白质组学

肿瘤细胞及其微环境（如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞）中的生物标志物为免疫疗法的开发和评估提供了宝贵的生物学背景。单细胞分析在过去十年中迅速发展，但由于mRNA丰度与蛋白质丰度相关性低，mRNA丰度不能很好地预测细胞中蛋白质水平的生物学过程。

单细胞蛋白质组学的进展主要体现在样本制备和MS方法上。芯片法将悬浮细胞集中在纳升液滴中，通过机器人纳升级液体分液直接在聚焦的液滴上加入试剂，最大限度地减少样本制备过程中的样品损失，提高蛋白质鉴定数量。CellenONE机器人平台实现了单细胞分离和纳升级液体分液与混合的自动化，每天可制备超过3,000个样本。

为匹配样本制备通量，质谱方法也大幅提升。现代DIA方法和增加灵敏度及数据采集速度的质谱仪将LC-MS进样间隔时间缩短至5分钟，即每天288个样本。化学标记多重分析技术是提高通量的主要解决方案，特别是串联质量标记(TMT)技术，可在一批实验中多重分析18个样本，最近甚至扩展到35个样本。使用32-plex单细胞多重分析方法，每天可分析1,018个人类单细胞，每个细胞鉴定800-1,200种蛋白质。

荧光激活细胞分选(FACS)非常适合将单细胞和单细胞群体分离到384孔板中，已用于单细胞蛋白质组学研究。在一项突出应用中，单细胞蛋白质组学用于表征急性髓系白血病模型中的细胞层次结构，通过FACS分选原始细胞、祖细胞和白血病干细胞，从超过2,000个细胞中定量约1,000种蛋白质，识别细胞分化阶段的功能差异。这项研究将单细胞蛋白质组学从概念验证和优化推向了直接的生物医学研究应用。

蛋白质形式研究

蛋白质形式研究已成为临床蛋白质组学的核心焦点，用于理解疾病和实现个性化医疗。"蛋白质形式"描述了单个基因产物蛋白质的不同结构范围，包括氨基酸序列变异和翻译后修饰(PTMs)。这种蛋白质结构的多样性贡献了人类和动物中观察到的生物学复杂性。

当特定蛋白质形式的浓度在病理状态下升高或降低时，它们可作为疾病生物标志物。重要的是，与炎症（如CRP、血清淀粉样蛋白A、钙卫蛋白(S100A8/9)）和肾功能障碍（胱抑素C）相关的蛋白质形式的个体内重复性已得到证实，允许它们作为生物标志物使用。

血浆生物标志物发现的亲和力方法

基于亲和试剂捕获和检测特定蛋白质的新技术因性能特征、成本和可用性而受到越来越多的关注。使用配对核苷酸标记抗体探针（Olink）和具有慢解离动力学的单链DNA适体试剂（SomaScan）的平台可实现数千种蛋白质的高效多重分析和高样本通量自动化。

Olink平台的创新在于邻近延伸分析(PEA)技术，通过将亲和蛋白质组学与下一代测序(NGS)读出相结合，实现高特异性和检测灵敏度。每种蛋白质由两种带有互补寡核苷酸标签（DNA标签）的抗体靶向。当两种抗体与靶蛋白结合时，DNA标签杂交并延伸，形成每个分析蛋白质的独特DNA条形码。双链DNA然后使用聚合酶链反应(PCR)扩增，并通过Illumina NovaSeq或Illumina NextSeq平台上的NGS进行定量。Olink Explore可分析约6,000种蛋白质，适用于生物标志物发现。

SomaScan是一种高通量、基于适体的蛋白质组学分析，设计用于同时测量数千种具有广泛内源性浓度范围的蛋白质。最新版本可同时测量高达11,000种人类蛋白质，使用55μL血清、血浆或其他液体样本。它使用SOMAmer试剂，即经过修饰的单链DNA适体，以高特异性和灵敏度结合特定蛋白质。目标蛋白质涵盖广泛的疾病范围，采用分层稀释方法分别测量极高丰度和极低丰度蛋白质，总测量范围达10个数量级。

尽管每个平台的内部和间系数变异(CVs)可接受，但这两个平台对相同靶点的相关性较差。Olink平台与ELISA对特定靶点相关性良好，但SomaScan在早期版本中并非如此，最近迭代有所改善。其他缺点包括Olink和SomaScan都需要至少20个靶点，而移植物抗宿主病(GVHD)预后标志物的AUROC>0.8通常需要少于5种蛋白质。定量是相对的而非绝对的，因为没有像ELISA那样的标准曲线。因此，这些平台更适用于发现而非生物标志物panel的验证。

蛋白质组学的系统生物学方法

在蛋白质组水平理解生物体将有助于逻辑模型的发展，因为蛋白质由于翻译后修饰(PTMs)而高度修饰，因此与更静态的基因组相比明显更多样化。系统生物学构成了基于知识的建模和组学数据驱动方法之间的交叉。生物信息学是一个广泛的多学科领域，对系统生物学不可或缺，处理组学数据、数学建模和网络分析。

当前全球蛋白质组分析的系统生物学研究工具只能使用任何生物系统中总可量化蛋白质的信息。蛋白质候选物可以通过通路和网络分析进一步检查，这些方法寻找相互作用的伙伴或配体。所有表达的蛋白质和相关的相互作用组信息可用于设计生物系统的可行模型，从而可在系统的系列扰动实验中进行测试。

临床生物标志物的蛋白质组学实施

美国食品药品监督管理局(FDA)和国家卫生研究院(NIH)联合建立的"生物标志物、终点和其他工具"(BEST)资源定义了五种类型的生物标志物：诊断性、风险性、预后性、预测性和反应/监测性。在GVHD的情况下，这些定义推断移植后时间。

生物标志物的开发复杂，涉及从发现到常规临床患者护理实施的许多步骤。这些步骤必须全部遵循，以确保新发现生物标志物的有效性和临床实用性。开发临床用生物标志物涉及几个步骤。第一步是发现阶段，通常比较病例和对照。候选生物标志物是选择因其在病例和对照间差异表达、生物学合理性而选择的蛋白质，并且可以在高通量分析（如ELISA）上运行。一旦新发现的生物标志物证明有希望的统计有效性（通过接收者操作特征(ROC)曲线评估），必须在独立队列（理想情况下大型且来自多个机构）上进行验证。最后，生物标志物应经过验证。这通常通过大型前瞻性研究完成，这些研究还可以帮助确定特定结果和临床使用的高风险或低风险的截断值。

细胞治疗中经过验证的血液蛋白质组学生物标志物

在细胞治疗，特别是造血细胞移植(HCT)和嵌合抗原受体T(CAR-T)过继细胞转移的毒性和有效性方面，具有最大支持有效性的风险、诊断和预后预测生物标志物总结如下。

在造血细胞移植中，同种异体造血细胞移植(HCT)被广泛认为是最经过验证的细胞治疗，因为它是细胞免疫治疗最常见的形式，并且已广泛使用超过60年。随着全球超过一百万例移植完成，它为干细胞治疗、免疫调节技术和个性化癌症治疗（如CAR-T过继转移）的进步铺平了道路。

急性GVHD诊断时获得的IL-2受体-α(IL-2Rα)、肿瘤坏死因子受体-1(TNFR-1)、 interleukin-8(IL-8)和肝细胞生长因子(HGF)的生物标志物panel能够确认诊断时的急性GVHD。Reg3α，一种主要存在于胃肠道(GI)道潘氏细胞中的肽，已成为GI道急性GVHD最经过验证的生物标志物。T细胞免疫球蛋白粘蛋白蛋白-3(TIM3)的可溶形式也与GI道急性GVHD相关。移植后28天，TIM3浓度加上ST2，与2年非复发死亡率(NRM)相关。

刺激物-2(ST2)，或IL1RL1（基于HUGO命名法的新名称），是白细胞介素-33(IL-33)的诱骗受体，参与炎症信号传导。移植后，IL1RL1是急性GVHD最经过验证的生物标志物，已在多种临床场景中研究。当在皮质类固醇治疗开始时测量ST2时，高ST2患者对治疗耐药性急性GVHD的可能性超过两倍。移植后7天测量的ST2和Reg3α用于创建预后算法，将患者分为具有显著不同6个月NRM的组。

内皮激活和压力指数(EASIX)使用乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐和血小板计数计算。在回顾性和前瞻性队列中，它与急性GVHD风险增加和死亡率相关。由ST2、CXCL9、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和骨桥蛋白(OPN)组成的4种生物标志物panel在诊断时和移植后100天与慢性GVHD显著相关。CD163是氧化应激期间由激活的单核细胞/巨噬细胞脱落的清道夫受体。移植后80天的CD163浓度与新生慢性GVHD相关。在234例儿科受者队列中，包括调节性自然杀伤细胞、初始CD4辅助T细胞和初始调节性T细胞减少，以及CXCL9、CXCL10、CXCL11、ST2、ICAM-1和可溶性CD13(sCD13)水平升高的分类器表征了慢性GVHD的发生。

Dickkopf相关蛋白3(DKK3)，一种参与纤维化的Wnt信号调节剂，通过MS/MS蛋白质组学被鉴定为硬化性皮肤慢性GVHD的潜在诊断生物标志物，但在其他形式的慢性GVHD中也升高。在最近一项慢性GVHD风险生物标志物研究中，在总计982例患者的队列中，未来发生慢性GVHD的患者在移植后100天，包括CXCL9、MMP3和DDK3的panel升高。

原发性疾病复发仍然是移植后死亡的主要原因，监测微小残留病(MRD)至关重要，特别是如果患者携带TP53突变，这些突变存在于19%的患者中，与较短生存期和较短复发时间相关。一项研究使用完整蛋白质分析系统分析了经历移植物抗白血病(GVL)和急性GVHD的患者在供体淋巴细胞注射(DLI)后的血浆蛋白质组，与经历GVL而无GVHD的患者蛋白质组进行比较。

在CAR-T细胞治疗中，新型基因工程免疫疗法改善了晚期血液恶性肿瘤患者的结局。截至2025年，七种FDA批准的CAR-T疗法可用。利用和标准化这些新型CAR-T细胞治疗的毒性和有效性生物标志物将有助于更好地管理副作用和预测治疗结局。

CAR-T细胞治疗的3种主要毒性是细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICAN)和血细胞减少。输注后早期时间点血浆IL6与最严重毒性相关，是与CRS/ICAN最经过验证的细胞因子。IL6临床测定必须在研究和临床实验室间标准化。基线组合C反应蛋白(CRP)和铁蛋白公式与基线IL6相关，并在3组（低、中、高）中进行风险分层，对总生存期具有预后意义。输注前EASIX公式与输注后第7天相关，并与≥3级CRS和/或ICAN相关。

对于血细胞减少，Rejeski等人开发了CAR-HEMATOTOX模型，包括基线造血储备（如血小板计数、血红蛋白和ANC）和炎症（如CRP和铁蛋白）参数，与延迟性血细胞减少相关。对于与肿瘤评估相关的生物标志物，与造血细胞移植一样，基线肿瘤负荷和特征