综述：通过空间转录组学揭示阿尔茨海默病中的小胶质细胞网络

本综述系统阐述了空间转录组学（ST）技术如何揭示阿尔茨海默病（AD）中淀粉样斑块（Aβ）微环境内小胶质细胞（microglia）的区域异质性、功能多样性及其与星形胶质细胞（astrocytes）、神经元（neurons）和少突胶质细胞（oligodendrocytes）的动态相互作用。文章强调了小胶质细胞在衰老（aging）和AD进程中的核心作用，包括其与TREM2、ApoE等AD风险基因的关联，以及其作为潜在治疗靶点（therapeutic avenues）的价值。

　　

背景

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，其主要病理特征包括淀粉样（Aβ）斑块、神经原纤维缠结（NFTs）、胶质增生（gliosis）和神经元丢失。近年来，全基因组关联研究（GWAS）发现许多常见风险等位基因可能通过影响小胶质细胞（microglia）中的基因表达来改变疾病表型。单细胞RNA测序（scRNA-seq）进一步揭示了小胶质细胞状态的多样性，将其多功能角色与神经炎症和神经退行性变联系起来。然而，一个基本问题仍未解决：小胶质细胞及其邻域如何与AD大脑中的病理特征相互作用？

空间转录组学技术概述

空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）技术可分为成像基础（img-ST）和测序基础（seq-ST）两大类方法。

img-ST方法建立在荧光原位杂交（FISH）的基础上，旨在以亚细胞分辨率检测单个mRNA分子。例如，MERFISH（由Vizgen商业化为MERSCOPE）采用汉明距离为4的编码系统确保条形码之间的最小距离，从而实现稳健的多重杂交。seqFISH则通过编码条形码和不同荧光团标记的读出探针在连续成像轮次中进行组合“伪色”读出，以识别数千种转录本。此外，原位测序（ISS）技术依赖padlock探针，这些探针通过逆转录杂交cDNA序列并环化，然后通过滚环扩增（RCA）在杂交位点产生离散的集落（局部扩增产物），随后通过连接化学测序解码条形码序列，达到近单核苷酸分辨率。10x Genomics的Xenium和STARmap是 notable 的商业化平台。

seq

seq-ST方法利用空间条形码寡核苷酸阵列从安装的组织切片中捕获整个转录组。Stahl等人开创的概念后来演变为10x Visium等平台，其使用载玻片上预定义的捕获点以约50μm的分辨率收集mRNA，同时保留组织结构。Slide-seq通过将密集堆积的DNA条形码珠子沉积到表面上，实现了约10μm的更高空间分辨率。DBiT-seq（组织中的确定性条形码）采用微流体通道将条形码直接递送到组织切片上，从而能够以高空间分辨率同时分析多个分子层。华大基因的Stereo-seq利用纳米球DNA进行mRNA检测，分辨率可达约220 nm。

这些方法通常在转录组覆盖范围、空间背景分辨率和多模块检测之间进行权衡，凸显了该领域持续创新的必要性。

小胶质细胞的区域和功能异质性

小胶质细胞广泛分布在整个大脑中，约占中枢神经系统细胞的4-10%。尽管传统上被认为是一个相对同质的群体，但许多研究揭示了小胶质细胞在密度、形态和转录谱方面存在显著的区域异质性。例如，在全脑范围内观察到一种梯度模式，即小胶质细胞在脑的喙侧和背侧区域更丰富，而在腹侧和尾侧区域较少。皮质、纹状体和海马体的小胶质细胞密度相似，而丘脑和中脑的密度近乎一半，小脑则更低。

小胶质细胞表现出一系列功能状态，其通过多种细胞表面标记物促进，使其能够检测和响应环境变化。疾病相关小胶质细胞（Disease associated microglia, DAMs）首先在5xFAD和APP/PS1小鼠的scRNA-seq中被鉴定出来。此外，在AD病理小鼠模型中还表征了激活反应小胶质细胞（Activated response microglia, ARMs），而与神经炎性营养不良相关的微神经退行性表型（microglial neurodegenerative phenotype, MGnD）则在包括肌萎缩侧索硬化（ALS）和多发性硬化（MS）在内的多种神经退行性疾病模型中被观察到。值得注意的是，ARMs和MGnDs与DAMs有许多相似的标志。激活后，小胶质细胞上调一系列定义DAMs的基因，如Clec7a、B2m、Apoe、Trem2及其衔接子Tyrobp，以及参与吞噬作用和脂质代谢的基因，如Cst7和Lpl。

在神经退行性疾病模型中，如面神经轴突切断模型和脱髓鞘 pathogenesis 模型，小胶质细胞显著激活，同时胼胝体中少突胶质细胞丢失。在这些背景下，包括Fam20c、Cst7、Ccl6、Fn1、Ank、Psat1和Spp1在内的基因在脱髓鞘相关小胶质细胞中以不同程度富集。在健康人脑和MS患者大脑中也鉴定出了类似的相应集群。此外，在衰老、神经退行性疾病和其他病理中观察到了一种保守的小胶质细胞状态，其特征为I型干扰素（IFN）反应特征，即干扰素反应基因（如Ifit3、Oasl2和Irf7）富集。

淀粉样斑块生态位中的小胶质细胞

AD研究的一个核心问题是淀粉样斑块如何与神经退行性过程相关。淀粉样斑块可能作为AD的初始触发因素，遗传学研究已将散发性AD风险与小胶质细胞表达的、响应淀粉样沉积而激活的基因联系起来。在淀粉样斑块附近，小胶质细胞表现出激活的“阿米巴样”形态，具有更大的细胞体和更少、回缩的突起。在这种激活状态下，小胶质细胞通过内吞作用参与淀粉样沉积，并有助于斑块致密核心的重塑。DAMs和MGnD主要存在于斑块周围。

AD脑组织中的scRNA-seq革命性地改变了我们对细胞异质性的理解，揭示了在人类和小鼠AD模型中，小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞中基因表达的显著和多样化变化。此外，星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞也对淀粉样斑块表现出改变的分子反应。然而，为了完全捕捉淀粉样斑块、tau聚集、细胞死亡和突触丢失之间的空间关系，并解析由此产生的复杂细胞反应，ST已成为不可或缺的工具。

首个在AD小鼠和人类大脑样本中进行的ST研究确定了与淀粉样斑块相关的多细胞共表达基因网络，称为斑块诱导基因（plaque-induced genes, PIGs）。斑块细胞生态位是通过扩展Aβ染色边界50μm的掩蔽区域来定义的。在App^NL-G-F小鼠模型中使用100μm点成像大小的seq-ST方法，并辅以相邻脑组织的Aβ染色，鉴定出57种不同的PIGs。这些PIGs与DAMs和炎症性星形胶质细胞有很强的关联。值得注意的是，虽然PIG反应主要由小胶质细胞驱动，但通过img-ST原位测序方法证实，几种PIGs在多种细胞类型中表达。

另一项在TauPS2APP小鼠模型中使用img-ST（STARmap Plus）的研究，同时分析了2,766种RNA物种以及针对淀粉样蛋白和磷酸化tau的抗体染色。在13种主要细胞类型中，小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）和内皮细胞在斑块附近相对富集。小胶质细胞在斑块周围的前10μm和10-20μm区域内最富集，而其他胶质细胞群体在10-30μm区域达到峰值。小胶质细胞的空间差异表达分析揭示了与细胞死亡调控（如Ccl3、C1qa和Ctsd）和细胞迁移调控（如Cd9、Apoe和Trem2）相关的基因，这些基因与DAM特征重叠。

淀粉样斑块生态位中的小胶质细胞邻居

星形胶质细胞也是淀粉样斑块生态位中的关键参与者。反应性星形胶质细胞，如疾病相关星形胶质细胞（disease-associated astrocytes, DAA），在AD患者和小鼠模型中具有特征性基因特征，表明AD中的主要转录反应涉及多种细胞类型，特别是对小胶质细胞的反应。在TauPS2APP小鼠的皮质和海马区域，DAA样细胞约占所有星形胶质细胞群体的14%，它们在斑块周围中等距离（10-40μm）处富集，并以Gfap、Vim和Ctsb基因的表达为标志。

少突胶质细胞也对淀粉样病理有反应。在5xFAD小鼠大脑中，少突胶质细胞表现出进行性转录反应，上调诸如C4b、Serpina3n和H2-d1等基因。Aβ和Olig2 RNA的共标记显示少突胶质细胞特异性斑块相关特征的显著增加。有趣的是，区域因素而非单纯的Aβ负荷似乎驱动少突胶质细胞基因表达：虽然少突胶质细胞模块在早期（例如App^NL-G-F小鼠3个月时）上调，但它们在 immediate 斑块生态位内减少。这表明早期保护性反应可能最终随着斑块负荷增加而被压倒。

与胶质细胞的积累相反，斑块周围的神经元密度逐渐下降。几种PIGs在神经元中显著增加，包括溶酶体酶（Lgmn、Ctsa）、溶酶体降解调节因子（Gns和Grn）、Aβ聚集抑制剂（Itm2b）以及在神经元中表达的胰岛素生长因子调节因子（Igfbp5）。Serpina3随着疾病进展将其主要表达从神经元转变为星形胶质细胞。

小胶质细胞与易损神经元

神经元内错误折叠的tau蛋白聚集物的积累是AD的一个定义性特征。在人类大脑皮层中，受AD病理影响最早的区域是内嗅皮层和 transentorhinal 皮层，其次是海马CA1区域。几种神经元亚型被报道在AD中特别易损。

脑萎缩主要由神经元丢失和突触变性驱动。突触丢失与人类和动物AD模型中的认知衰退密切相关。事实上，有证据表明可溶性形式的Aβ和tau物种诱导突触毒性并通过神经回路传播。此外，小胶质细胞和星形胶质细胞可以通过摄取被标记的突触，在衰老和AD动物模型中驱动突触变性，从而导致认知衰退。

使用STAR-MAP进行的直接体内观察使得能够同时可视化磷酸化tau（p-tau）和小胶质细胞。在TauPS2APP小鼠模型中，p-tau信号在8个月时主要在海马区域观察到，并在13个月时在海马和皮质区域变得更加明显。通过分析p-tau染色周围20μm网格方格内细胞类型组成与p-tau密度的协变，分析了细胞类型和基因表达模式。少突胶质细胞是胼胝体和海马体中高p-tau信号附近最显著富集的细胞类型。在8个月时，大多数p-tau阳性神经元是CTX-Ex2兴奋性神经元，而在13个月时，大多数p-tau阳性神经元是海马的CA1兴奋性神经元。抑制性神经元占p-tau阳性神经元的不到20%，其中大多数在8个月时是Pvalb神经元，而在13个月时，大多数来自Sst群体。此外，定量分析显示p-tau信号也在淀粉样斑块10μm半径内富集。鉴于该区域内神经元细胞体的相对减少，观察到的p-tau信号可能归因于围绕斑块积累的营养不良（受损）神经突。

衰老大脑中的小胶质细胞

老年与认知功能下降和神经退行性疾病（如AD）风险增加相关。在衰老过程中，大脑表现为灰质和白质的变性。白质主要由有髓鞘轴突组成，连接不同大脑区域的神经元，对于与认知障碍和痴呆风险增加相关的功能电路的完整性至关重要。值得注意的是，衰老诱导的有髓神经纤维损伤的特征是释放富含脂质、紧密压缩的髓鞘碎片，这些碎片难以清除。这种脱髓鞘过程也被认为是淀粉样沉积的一个来源。髓鞘功能障碍导致轴突肿胀内Aβ产生机制的积累，并增加皮质淀粉样前体蛋白的切割。

来自解剖白质的分类小胶质细胞的转录组分析揭示了 distinct 的特征，这些特征富集了DAM和MHC II类相关基因。这些小胶质细胞倾向于形成3-5个细胞簇，具有大细胞体和粗 processes。在铜宗处理的脱髓鞘和再髓鞘化小鼠模型的小胶质细胞中也观察到了类似的转录组特征，其中诸如Apoe、Axl、Igf1、Lyz2、Itgax、Gpnmb和Apoc1等基因在两个阶段都上调。将MERFISH与电子显微镜（EM）相结合的创新方法进一步表征了脱髓鞘相关小胶质细胞，其在溶血磷脂酰胆碱（LPC）诱导的白质损伤的再髓鞘化病变中心具有“泡沫样”形态。充满脂滴的泡沫样小胶质细胞不仅表达DAM特征，还表达参与脂质和胆固醇代谢的基因（如Plin2、Soat1、Abca1和Abcg1）。在病变中，泡沫样小胶质细胞发现与干扰素反应小胶质细胞（富含Stat1、Ifit1、Usp18和Rsad2）、少突胶质细胞、星形胶质细胞和CD8⁺ T细胞紧密接近。

使用scRNA-seq和ST的多项研究证实，随着年龄增长，非神经元细胞在细胞状态、基因表达和空间组织上的变化比神经元更多。例如，胼胝体被证明是受衰老影响最严重的大脑区域之一。此外，下丘脑的第三脑室（V3）显示年龄特异性和细胞特异性差异表达基因。这些研究共同揭示了免疫调节和主要组织相容性复合体I类（MHC-I）介导的抗原呈递基因的富集。相反，许多神经元类型显示与神经元结构和功能相关基因的表达减少。

小胶质细胞表现出随年龄变化表达基因数量最多。一项使用针对421个基因的MERFISH探针 panel 的研究计算了衰老小鼠大脑额叶皮质和纹状体中的“激活分数”。激活分数是基于小胶质细胞（B2m、Trem2、Ccl2、Apoe、Axl、Itgax、Cd9、C1qa、C1qc、Lyz2、Ctss）和星形胶质细胞（C4b、C3、Serpina3n、Cxcl10、Gfap、Vim、Il18和Hif3a）的选定基因表达计算的。数据显示，在老年动物中富集的星形胶质细胞和小胶质细胞簇与相邻少突胶质细胞的炎症水平相关。另一项使用300个基因 panel 的MERFISH探针的研究确定了小鼠整个生命周期大脑中每个细胞的“空间衰老时钟”。“空间衰老时钟”预测小胶质细胞会加速附近细胞的衰老。将空间衰老时钟应用于已发布的ST数据集，作者发现小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞在响应LPS时表现出加速衰老。小胶质细胞在AD中也显示出加速衰老，与DAM富集一致。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）脱髓鞘模型中，小胶质细胞衰老在整个大脑中加速，而在局部脱髓鞘损伤中，所有细胞类型在损伤周围都发生加速衰老。

除了胶质细胞，T细胞和神经干细胞（NSC）也表现出最强的年龄相关变化。T细胞随着年龄增长 increasingly 浸润大脑，特别是在胼胝体和前连合区域。这些T细胞被假设发挥显著的促衰老邻近效应，这从IFNγ产生的 concomitant 增加以及附近细胞显示IFNγ反应基因（Bst2、Stat1）的协调增加中显而易见。相反，NSC对邻近细胞有强大的促 rejuvenating 邻近效应。NSC通常定位于侧脑室 throughout life，随后随着年龄增长而减少。NSC的邻近细胞显示“exocytosis”标记物如Cd9的表达增加，这一点通过免疫染色得到证实。

人类样本中的AD

AD的实验小鼠模型对于理解疾病机制至关重要，但研究证明它们在完全代表人类AD大脑环境和分子复杂性方面存在局限性。早期奠基性的人类PIGs（斑块诱导基因）img-ST研究揭示了人类淀粉样斑块生态位内的细胞组成。PIGs和少突胶质细胞富集基因的共表达网络显示，仅在AD晚期人类大脑样本中有类似改变。多项研究现已开始应用单细胞和空间基因组学来识别AD人类大脑中的细胞脆弱性和分子变化。通常使用来自脑库的死后样本进行的人脑研究，为理解潜在的病理生理机制提供了前所未有的见解，特别是创建伴随AD进展的病理局部负荷的定量聚合指标。

最近的研究进一步 refined 我们对AD背景下人脑细胞结构的理解。例如，背外侧前额叶皮层的转录组规模 mapping 提供了可能导致认知衰退的区域基因表达差异的详细见解。同时，关注脆弱区域（如颞中回）的研究确定了与AD中选择性脆弱性相关的关键基因。新皮层和下丘脑的全面 mapping 揭示了 intricate 的细胞组织和空间细胞模式，不仅描绘了健康的大脑结构，还 pinpoint 了由疾病驱动的改变。

最近，空间分辨率和分析技术的进步使得能够比较遗传性和散发性AD。采用Stereo-seq和MERFISH等方法的研究以前所未有的细节绘制了前额叶皮层和其他大脑区域， uncovering 细胞类型特异性衰老特征，并揭示小胶质细胞激活和其他免疫反应如何有助于淀粉样蛋白-β清除。此外，对免疫AD患者小胶质细胞机制的研究突出了这些细胞在疾病进展和潜在治疗反应中的关键作用。这些空间转录组学研究不仅 mapping 了 underlying AD病理的复杂细胞相互作用，还通过阐明驱动神经退行性变的分子回路，为未来的诊断和治疗策略提供了蓝图。

结论

总之，空间转录组学的应用通过揭示 underpinning 其进展的复杂细胞结构和动态相互作用，显著增进了我们对阿尔茨海默病的理解。本综述强调了尖端成像和测序基础方法如何提供对关键细胞类型（尤其是小胶质细胞）的空间异质性及其在衰老和AD中与神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的复杂关系的前所未有的见解。尽管有这些有希望的进展，一些挑战仍然存在，例如实现更高的分辨率，整合多组学数据集，以及 fully 阐明驱动原位细胞-细胞相互作用的分子机制。

利用这些技术创新的未来研究有望加深我们对AD的机制理解并识别新的治疗靶点。例如，使用深层组织成像与ST相结合来 mapping 3D大脑中的全面相互作用细胞网络。与拉曼散射显微镜结合以识别AD细胞水平的代谢变化。通过进一步剖析脑细胞之间的空间相互作用，我们可以更好地理解局部微环境如何影响疾病发病机制和进展。此外，确定空间分辨的单细胞基因表达是理解细胞实现 context-dependent 表型机制的起点，但并未揭示 underlying 转录机制。为了实现这一目标，需要空间表观基因组学测定的并行发展。

此外，研究表明，在先天免疫挑战后，某些促炎mRNA水平升高并不一定与其相应蛋白质丰度相关，突显了小胶质细胞mRNA和蛋白质网络之间的分离，这很可能由转录后和翻译调控驱动。值得注意的是，空间蛋白质组学技术发展迅速，极大地有益于AD研究，特别是基于成像的蛋白质 inclusive 方法，这些方法以亚细胞分辨率多重检测30-60个蛋白质靶点。此外，质谱成像（MSI）能够直接在组织内可视化蛋白质和代谢物。人类大脑中Aβ蛋白型的直接可视化揭示了斑块异质性，这一点通过与组织病理学的共配准得到进一步证实。对各种tau亚型的检查发现了突触素和神经颗粒素水平与局部磷酸化tau（p-Tau）负荷之间的负相关。此外，多个平台证明了小胶质细胞异质性并鉴定了斑块相关小胶质细胞亚群， reinforcing 空间转录组学研究的结果。最终，对这些细胞网络的全面理解将为更有效、有针对性的干预措施铺平道路，以对抗AD并改善 aging 人口的认知结果。