从单层到球体：基于A549和HEK293细胞的二维与三维培养模型评估甲型流感病毒感染研究

本刊编辑推荐：为解决传统二维(2D)细胞模型在模拟体内病毒感染微环境方面的局限性，研究人员开展了基于藻酸盐(Alg)和藻酸盐-甲基纤维素(Alg+MC)基质的三维(3D)培养模型研究甲型流感病毒(A/PR/8/34)感染特性。研究发现Alg+MC基质因其多孔性和较低内聚力更利于病毒接触细胞，在HEK293和A549细胞中均观察到病毒复制优势，为呼吸道病毒研究提供了更生理相关的实验平台，对病毒-宿主相互作用研究和抗病毒药物开发具有重要意义。

在人类与传染病的漫长斗争中，病毒性疾病始终是重大健康威胁。尽管在疾病预防控制方面取得显著进展，但病毒性疾病的诊断和治疗机制仍需不断完善。传统病毒学研究主要依赖二维(2D)细胞培养模型，这种在平面塑料材料（如培养皿和多孔板）上生长细胞的方式，虽然为病毒复制生物化学和分子生物学研究做出了重要贡献，却难以模拟体内微环境的生理复杂性。此外，动物模型存在成本高昂、伦理问题以及物种特异性等局限。为了克服这些挑战，三维(3D)细胞培养模型应运而生，包括球体、类器官和支架系统等，能够更好地模拟组织结构、细胞间相互作用以及营养和氧气梯度，为病毒感染研究提供更生理相关的平台。

尽管3D模型具有明显优势，但其应用仍面临技术难度大、耗时且成本较高的挑战。甲型流感病毒作为重要的呼吸道病毒，其研究迫切需要更先进的模型系统。来自伊朗巴斯德研究所和德黑兰医学科学大学的研究团队在《Virology Journal》发表了创新性研究，通过建立A549（人肺泡上皮细胞）和HEK293（人胚胎肾细胞）的3D培养模型，系统比较了这两种细胞在藻酸盐(Alg)和藻酸盐-甲基纤维素(Alg+MC)两种基质中的甲型流感病毒感染特性。

研究人员运用了几项关键技术方法：通过扫描电子显微镜(SEM)表征水凝胶基质结构；使用Alamar Blue法测定球体活力和增殖率；通过Image J软件进行球体尺寸测量；采用免疫荧光染色验证球体组装；利用血凝(HA)试验和qPCR技术进行病毒滴度测定和基因表达分析；最后通过统计学方法比较2D与3D培养中的病毒复制差异。

球体形成与表征

研究成功在Alg和Alg+MC两种基质中培养了A549和HEK293细胞球体。SEM成像显示，两种水凝胶均具有多孔结构，其中Alg+MC基质比单独Alg基质表现出更多孔隙，这种结构有利于营养物质流动和细胞废物清除。

球体从培养第3天开始形成，表现出圆形、明显组装且培养过程中无坏死核心的特征。尺寸测量显示HEK293细胞在Alg+MC基质中形成更大的球体，特别是在第7天差异显著(P<0.0001)。而在单独Alg条件下，A549球体在第10天尺寸超过HEK293细胞(P<0.05)。

增殖实验表明，A549细胞在Alg+MC基质中的增殖率低于Alg基质，第5天后出现统计学显著下降(P<0.05)。HEK293细胞在两种基质中均保持90%以上的细胞活力，显示良好的代谢活性。基于这些结果，研究确定第3-5天为病毒接种的最佳时间窗口。

免疫荧光染色进一步证实了球体的成功组装，DAPI和F-actin染色显示存在有序的细胞核和肌动蛋白细胞骨架。

病毒适应结果

研究人员通过连续传代使甲型流感病毒适应A549和HEK293细胞。结果显示，HEK293细胞第8代接种物和A549细胞第5代接种物的HA效价达到32，Ct值分别为18.65和19.70。TCID₅₀测定显示最高感染剂量分别为10^3.5和10^2.5。连续传代过程中，两种细胞均出现逐渐增加的细胞病变效应(CPE)。

3D细胞培养接种结果

病毒接种后，研究人员监测了0、24和48小时的细胞形态变化并记录了CPE。所有收集的2D和3D样本（外部上清S1和内部上清S2）均进行了qPCR分析。

对于HEK293细胞，在溶解的样本中，Alg+MC的外部上清显示病毒基因表达减少最少（11.70倍）。在未溶解的样本中，Alg的外部上清（14.48倍）以及Alg+MC的外部（36.91倍）和内部（19.66倍）上清显示最低的减少程度。

对于A549细胞，在溶解的样本中，Alg（23.57倍）和Alg+MC（5.31倍）的内部上清显示最低减少。在未溶解的样本中，Alg的外部（53.86倍）和内部（51.58倍）上清以及Alg+MC的内部上清显示最低减少。

将3D培养的Ct值与2D样本的Ct值进行标准化比较后发现，HEK293细胞的3D处理均未显示病毒基因表达的显著减少(P>0.05)，而A549细胞的所有处理在两种基质中均显示与2D相比的显著减少(P<0.05)。

研究结论表明，Alg+MC基质因其增加的多孔性和较低的内聚力，比单独Alg更容易溶解但更难重新固化。该基质中观察到较高病毒复制的一个可能解释是它可能促进了病毒对细胞的更好接触。未来通过增加该系统中病毒-细胞相互作用时间的改进可能进一步提高感染效率。

这项研究的创新性在于首次使用3D球体培养进行病毒传播研究，并比较了两种不同的培养条件。与已建立的3D系统（如Matrigel、胶原-Matrigel支架和类器官）相比，Alg基和Alg+MC模型在成本、重现性和操作简便性方面具有显著优势。虽然3D球体模型在病毒产量方面并未持续优于2D培养，但为在更生理相关的环境中研究流感感染奠定了重要基础。未来的研究应侧重于调节3D微环境以更好地重现体内条件并提高病毒产量，这将为病毒-宿主相互作用研究、抗病毒药物筛选和疫苗开发提供更有价值的平台。