革兰氏阳性菌Priestia megaterium利用废弃原料高效生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的机制与应用研究 中文标题 利用废弃原料解锁革兰氏阳性Priestia megaterium高效生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的机制与应用研究

本研究针对传统聚羟基脂肪酸酯（PHA）生产菌株多为革兰氏阴性菌（易产生内毒素）及原料成本高的问题，从红树林根际土壤中分离出一株革兰氏阳性菌Priestia megaterium GM-4，通过优化甘蔗糖蜜和玉米浆等废弃原料发酵条件，实现了13.60 g/L菌体干重和9.84 g/L PHA的高效生产，全基因组分析揭示了其多底物代谢通路与PHA合成机制，为低成本、无内毒素生物医用材料开发提供了新策略。

　　

随着全球石油基塑料污染问题日益严重，开发可生物降解的替代材料成为当务之急。聚羟基脂肪酸酯（PHA）因其完全生物降解性和优异生物相容性，被视为理想替代品，尤其适用于高端生物医学领域（如组织工程支架和药物载体）。然而，当前PHA生产面临两大瓶颈：一是工业主流生产菌株多为革兰氏阴性菌（如Cupriavidus necator），其细胞壁脂多糖（内毒素）可能引发健康风险，限制了在医疗领域的应用；二是原料成本占总生产成本近50%，制约了规模化推广。针对这些问题，研究人员致力于寻找无内毒素且能利用低成本原料的高效生产菌株。

本研究通过从深圳福田红树林根际土壤中分离筛选出一株革兰氏阳性菌GM-4，经鉴定为Priestia megaterium（巨大普里斯特菌）。通过优化发酵条件，并利用甘蔗糖蜜（碳源）和玉米浆（氮源）等废弃原料，显著提升了PHA产量。研究采用全基因组测序、气相色谱（GC）、透射电镜（TEM）、核磁共振（NMR）及热分析等技术，系统评估了菌株的代谢特性、聚合物结构及材料性能。

主要技术方法

1. 1.
   菌株分离与筛选：从红树林根际土壤样本中富集培养，通过¹⁶S rRNA测序和phaC基因PCR鉴定PHA生产菌株。
2. 2.
   发酵优化：以甘蔗糖蜜（30 g/L）和玉米浆（10 g/L）作为低成本原料，在摇瓶规模进行发酵实验。
3. 3.
   PHA提取与表征：采用氯仿溶剂萃取法提取PHA，通过GC定量分析，TEM观察胞内颗粒，NMR和X射线衍射（XRD）鉴定聚合物结构（确认为聚羟基丁酸酯PHB），凝胶渗透色谱（GPC）和差示扫描量热法（DSC）分析分子量及热性能。
4. 4.
   基因组分析：通过全基因组测序（NCBI提交号SUB14899169）注释代谢通路，使用GO、KEGG、COG等数据库解析碳源利用与PHA合成关联基因。

研究结果

1. 高效PHA生产菌株的筛选与鉴定

通过五轮富集培养从红树林土壤中分离出8株细菌，其中4株（GM-4、GM-7、GM-8、GM-9）携带phaC基因（PHA合酶关键基因）。GM-4在以葡萄糖为碳源时表现最佳，菌体干重（DCW）达5.4 g/L，PHA含量占细胞干重63%（3.4 g/L），远超其他分离株（PHA含量21.3%~53.2%）和已知工业菌株（如C. necator DSM 428仅0.28 g/48 h）。GM-4被鉴定为革兰氏阳性杆状菌（

），无内毒素特性，且生化特性显示其具有催化酶和氧化酶活性。

2. 废弃原料显著提升发酵效率

碳源筛选表明，甘蔗糖蜜效果最优，DCW和PHA产量分别达8.01 g/L和5.36 g/L；蔗糖次之（6.81 g/L DCW，4.76 g/L PHA），而木糖、醋酸钠等转化效率较低。氮源优化中，玉米浆使DCW和PHA产量进一步提升至13.60 g/L和9.84 g/L，较葡萄糖基础培养基提升2.6倍和3.1倍（

）。该产量是已知野生菌利用废弃原料在摇瓶规模的最高水平之一（对比Halomonas halophila仅2.57 g/L PHA）。成本分析显示，甘蔗糖蜜和玉米浆作为农业副产品可降低原料成本50%，兼具经济与环境效益。

3. PHA材料特性符合医用标准

TEM显示GM-4胞内充满椭圆形PHA颗粒（

）。¹H-NMR和¹³C-NMR证实聚合物为聚羟基丁酸酯（PHB），特征峰包括甲基（1.24 ppm）、亚甲基（2.42–2.60 ppm）和甲氧基（5.23 ppm）。PSA分析平均粒径2.22 μm，适用于可降解组织粘合剂；XRD显示正交晶系结构（特征峰13°和17°），GPC测得数均分子量（M_n）118,251 Da，重均分子量（M_w）325,424 Da，分布指数（PDI）2.75；DSC显示熔融温度161.13°C，分解温度269.41°C，表明良好的热稳定性。革兰氏阳性特性确保无内毒素，符合医用材料要求。

4. 全基因组揭示多底物代谢通路

GM-4基因组大小5.47 Mb（GC含量38.01%），包含5,752个编码基因和15个sRNA。GO、KEGG和COG注释显示，碳水化合物代谢（尤其是糖酵解和磷酸戊糖途径）和氨基酸代谢基因丰富（

）。PHA合成关键基因包括3个phaA（乙酰-CoA乙酰转移酶）、1个phaB（乙酰乙酰-CoA还原酶）及phaC（合酶）与phaR（调节亚基）构成的独特双亚基系统（Gram阳性菌典型特征），与Gram阴性菌（如C. necator的phaCAB操作子）明显不同（

）。通路分析表明：

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  葡萄糖/蔗糖：通过PTS（磷酸转移酶系统）转运，经糖酵解生成乙酰-CoA，进入PHA合成途径。
• ?
  甘蔗糖蜜：富含蔗糖和营养素，通过蔗糖特异性PTS高效利用。
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  淀粉：由淀粉酶水解为麦芽糖，再通过α-葡萄糖苷酶转化为葡萄糖。
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  甘油：经甘油激酶和脱氢酶转化为甘油醛-3-磷酸，进入糖酵解。
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  醋酸钠：通过乙酰-CoA合成酶直接转化为乙酰-CoA。
  此外，基因簇中还发现调控基因phaP（颗粒大小调节）和phaQ（转录调控），以及单独定位的phaZ（解聚酶），表明精细的胞内PHA稳态调控机制。

结论与意义

本研究首次系统报道了Priestia megaterium GM-4利用甘蔗糖蜜和玉米浆实现高效PHA生产的能力，其产量（9.84 g/L）和转化效率在野生Gram阳性菌中位居前列。全基因组分析揭示了其多底物代谢灵活性（如糖类、甘油、醋酸）和独特的PHA合成基因架构（双亚基合酶系统），为理性改造提供了靶点。所产PHB具备优良材料特性（分子量、热稳定性、无内毒素），适用于生物医学领域（如药物载体和组织工程）。

未来工作需聚焦于：

1. 1.
   通过代谢工程强化底物利用（如木糖代谢模块）和PHA合成流量；
2. 2.
   优化提取工艺以克服Gram阳性菌细胞壁增厚导致的回收难题；
3. 3.
   在生物反应器中验证规模化生产潜力。
   该研究为低成本、可持续PHA生产提供了菌株资源和工艺策略，推动了生物塑料在循环经济中的应用。

论文发表于《Microbial Cell Factories》（2025年24卷210页），由北京大学环境科学与工程学院白心一等完成，DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-025-02803-z