利用解脂耶氏酵母代谢工程协同合成酚类单萜麝香草酚和香芹酚

本研究针对麝香草酚和香芹酚依赖植物提取或化学合成的问题，通过构建解脂耶氏酵母细胞工厂，强化甲羟戊酸（MVA）途径并优化细胞色素P450单加氧酶（TvCYP71D507）组合拷贝数，实现酚类单萜的从头合成，摇瓶产量达7.14 mg/L，生物反应器扩增至61.31 mg/L，为微生物高效生产高值萜类化合物提供新策略。

　　

麝香草酚（thymol）和香芹酚（carvacrol）是天然酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌等多种生物活性，广泛应用于香料、医药和农业领域。目前其主要来源仍依赖植物提取或化学合成，但植物提取受限于资源稀缺和成本高昂，化学合成则面临可持续性和环境问题。随着生物技术的发展，利用微生物细胞工厂生产萜类化合物成为一种绿色高效的替代方案。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种“一般认为安全”（GRAS）的酵母，因其强大的代谢能力和油脂积累特性，已成为生产高值化合物的理想底盘细胞。

近期，麝香草和香芹酚在百里香（Thymus vulgaris）中的完整生物合成途径被揭示：以香叶基二磷酸（geranyl diphosphate, GPP）为前体，经γ-松油烯合成酶（TPS2）催化生成γ-松油烯，再通过细胞色素P450单加氧酶（CYP71D亚家族）氧化为不稳定的环己二烯醇中间体，最后经短链脱氢酶/还原酶（SDR1）脱氢生成麝香草酚和香芹酚。尽管这一途径在植物中已明确，但在微生物中实现高效合成仍面临挑战，包括前体供应不足、酶表达效率低及产物毒性等问题。

为此，朱俊凯等人发表在《Microbial Cell Factories》的研究首次在解脂耶氏酵母中构建了麝香草酚和香芹酚的从头合成途径，并通过多策略代谢工程显著提升了产量。研究采用的关键技术方法包括：基于同源重组（HR）的基因整合技术（使用IntA_1、IntC_2、IntE_1等位点），CRISPR/Cas9介导的ku70基因敲除以提升整合效率，实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达，气相色谱（GC）分析产物含量，以及5-L生物反应器发酵优化。

研究结果：

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  毒性测试与途径构建：
  通过添加不同浓度麝香草酚和香芹酚，发现香芹酚对解脂耶氏酵母的毒性更强（100 mg/L即显著抑制生长），两者联合使用具有叠加效应。显微镜观察显示毒性浓度下细胞出现聚集现象。选择TvCYP71D507、TvTPS2和TvSDR1构建完整合成途径，初始工程菌CT04摇瓶产量为0.079 mg/L。
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  优化MVA途径提升前体供应：
  强化甲羟戊酸（MVA）途径关键基因：过表达截短型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（tHMG1）和异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）使产量提升8.56倍（CT14菌株）；替换内源法尼基二磷酸合酶（ERG20）为突变体ERG20^F88W-N119W（ERG20^WW）以减少GPP向法尼基二磷酸（FPP）的分流，产量进一步提升至1.66 mg/L（CT15菌株）。
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  增加合成途径拷贝数：
  在基因组位点IntE_1和IntA_1整合多拷贝TvCYP71D507基因组合（TvCYP71D507+TvTPS2+TvSDR1），但拷贝数增加至2倍（CT17菌株）时产量仅微增（2.91 mg/L），RT-qPCR显示酶表达水平未成比例提升，表明存在底物/辅因子限制。
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  恢复亮氨酸合成促进生物量：
  通过重新引入3-异丙基苹果酸脱氢酶基因（LEU2）解除亮氨酸营养缺陷，工程菌CT18生物量提高2.19倍（7.36 g/L），摇瓶产量达7.14 mg/L；5-L生物反应器发酵84小时产量升至61.31 mg/L，细胞干重80.19 g/L。

研究结论与意义：

该研究成功在解脂耶氏酵母中实现了麝香草酚和香芹酚的从头合成，产量较初始菌株提升18.44倍。通过强化MVA途径、优化GPP分支代谢和增加关键酶拷贝数，显著提高了前体供应和转化效率。恢复LEU2基因功能进一步解决了营养缺陷导致的生物量限制问题。这一工作不仅证明了解脂耶氏酵母作为酚类单萜生物合成细胞工厂的潜力，也为其他萜类化合物的微生物生产提供了可借鉴的代谢工程策略，包括酶工程、细胞区室化改造和适应性实验室进化（ALE）等方向。未来通过蛋白质工程、辅因子优化和毒性缓解策略，有望进一步提升产量并推动产业化应用。