噬菌体编码蛋白PavP通过双重抑制铜绿假单胞菌生长与毒力性状调控其致病性

为解决多重耐药铜绿假单胞菌感染治疗难题，研究人员开展噬菌体编码蛋白PavP调控毒力机制研究，发现该蛋白在抑制细菌生长同时，通过诱导活性氧（ROS）积累、调控生物膜形成、运动性及III型分泌系统（T3SS）表达，显著减弱细菌致病性，为开发双功能抗菌剂提供新策略。

　　

在当今抗生素耐药性危机日益严峻的背景下，多重耐药菌的泛滥已成为全球公共卫生的重大挑战。其中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种常见的革兰氏阴性机会致病菌，因其强大的内在和获得性耐药机制，以及形成生物膜（biofilm）的能力，尤其难以治疗。世界卫生组织已将其列为优先研发新型抗生素的重点病原体。传统的抗生素疗法效果日益有限，迫使科学家寻找替代策略，而噬菌体治疗（phage therapy）因其高特异性和安全性逐渐受到关注。然而，细菌对噬菌体也会产生抗性，因此深入了解噬菌体与宿主相互作用的分子机制，挖掘噬菌体编码的抗菌蛋白，成为开发新型抗感染治疗的重要方向。

在此背景下，Yang等人在《Biology Direct》上发表的研究聚焦于噬菌体PaoP5编码的一个小蛋白PavP（PaoP5_160），并系统探索了其对铜绿假单胞菌的生长抑制和毒力调控的双重功能。该研究不仅揭示了PavP通过诱导活性氧（ROS）积累发挥抑菌作用，还发现其在亚抑制浓度下调控多种毒力相关表型，包括运动性、生物膜形成和III型分泌系统（T3SS）的表达，最终显著降低细菌的整体致病性，为设计多靶点抗菌策略提供了新的分子基础。

为开展本研究，作者运用了多项关键技术方法：采用分子克隆技术构建PavP异源表达载体并转化至铜绿假单胞菌PAO1；通过生长曲线测定和斑点实验分析细菌生长抑制；利用共聚焦显微镜观察细胞形态和蛋白定位；通过体外酶活实验检测PavP的核酸酶、蛋白酶和溶菌酶活性；使用荧光探针法测定细胞内活性氧（ROS）水平；通过RNA-seq转录组测序分析全局基因表达变化；借助lux报告系统检测特定基因启动子活性；采用结晶紫染色和刚果红培养基分析生物膜形成和胞外多糖产生；通过运动性实验（游动、集群和抽搐运动）评估细菌运动能力；应用RT-qPCR验证毒力基因表达；最后利用Galleria mellonella（大蜡螟）感染模型评估体内致病性。所有测序数据已上传至BioProject（编号PRJNA1263686）。

PavP抑制铜绿假单胞菌生长

研究人员通过异源表达系统发现，PavP的过量表达显著抑制了PAO1的生长，且这一效应具有浓度依赖性，在高浓度IPTG诱导下抑制效果最强，而在低浓度（0.1 mM）时细菌生长可恢复。显微镜观察显示，PavP表达导致细菌细胞长度显著缩短（平均1.6 μm），但细胞膜完整性未受损（PI染色阴性），表明其作用为抑菌而非杀菌。此外，PavP在细胞内呈均匀分布，为进一步探究其机制提供了线索。

PavP诱导活性氧（ROS）积累

生物信息学分析提示PavP可能具有酶活性，但体外纯化蛋白实验排除了其具有核酸酶、蛋白酶或溶菌酶活性的可能。进一步检测发现，PavP表达显著提高了细胞内ROS水平，并伴随氧化应激相关基因（如oxyR、katA、sodM）的上调，表明PavP通过诱导氧化应激抑制细菌生长，这一机制为理解其抗菌功能提供了关键依据。

p<0.01;*p<0.001).B and C Similar results were obtained from three independent experiments, and the image shown are from one representative experiment'>

PavP调控的全局转录组分析

RNA-seq分析显示，PavP表达导致575个基因上调和1494个基因下调，这些基因广泛参与脂多糖合成、叶酸代谢、细菌趋化、双组分系统（two-component system）、氮代谢和鞭毛组装等通路，表明PavP对宿主代谢和毒力网络具有广泛影响，其中生物膜形成、运动性和T3SS相关通路变化尤为显著。

PavP促进生物膜形成

转录组数据和表型实验均证实，PavP显著上调胞外多糖合成基因（pelA-pelG），并通过cdrA报告系统检测到细胞内c-di-GMP（环二鸟苷酸）水平升高，从而增强生物膜形成和胞外多糖产生。共聚焦显微镜和刚果红染色进一步直观展示了PavP诱导的生物膜增厚和褶皱表型。

PavP调控运动性

PavP表达导致鞭毛和IV型菌毛相关基因（如fleQ、flgB–flgL、pilN等）显著下调，从而抑制了PAO1的游动、集群和抽搐运动。启动子报告实验（fliC-lux和flhA-lux）及运动性平板实验均验证了这一表型，表明PavP通过抑制运动器官的合成与组装削弱细菌迁移和定植能力。

PavP上调III型分泌系统（T3SS）

与毒力增强预期相反，PavP显著上调了T3SS相关基因（exsA–exsD、pscB–pscL、pcr2–pcrV等）的表达，RT-qPCR和exoT-lux报告基因实验进一步证实了exoY、exoT、exsA等关键毒力因子转录水平升高。尽管T3SS表达上调，但整体致病性却减弱，提示PavP可能通过多靶点调控重构了细菌的毒力网络。

PavP降低宿主细菌毒力

最终，通过Galleria mellonella感染模型评估整体致病性，发现PavP表达显著提高了幼虫存活率，表明尽管某些毒力表型增强，但PavP的净效应是减弱了铜绿假单胞菌的体内致病力，凸显其作为毒力调控剂的治疗潜力。

本研究系统阐明了噬菌体编码蛋白PavP通过浓度依赖性双重功能调控铜绿假单胞菌的生理与毒力：在高浓度下，它通过诱导ROS积累抑制细菌生长；在亚抑制浓度下，它重塑宿主转录组，增强生物膜形成和T3SS表达，但抑制运动性，最终显著降低整体致病性。这种多效性调控不仅有助于噬菌体在感染过程中优化宿主资源利用，也为开发新型抗菌剂提供了思路——即同时靶向细菌生长和毒力网络的双功能分子。尽管研究采用异源表达系统可能高估PavP的自然效应，但其作为抗毒力治疗先导分子的潜力值得深入探索，未来研究应聚焦于其结构基础、作用靶点及在天然噬菌体感染背景下的功能验证。