猪链球菌LXG毒素通过DUF4176稳定化机制增强细菌竞争性与致病性的研究

本研究针对猪链球菌（Streptococcus suis）在多微生物环境中通过VII型分泌系统（T7SS）介导的竞争与致病机制展开。研究人员发现LXG1-CT3毒素具有孔形成活性，并证明DUF4176家族蛋白作为分子伴侣稳定LXG效应子，显著增强细菌竞争力和小鼠感染模型中的毒力。该研究揭示了T7SSb分泌LXG效应子的新机制，为抗感染策略提供新靶点。

　　

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原体，可引起猪脑膜炎、败血症及猝死，同时对人类健康构成严重威胁。其在猪扁桃体中定植时需面临复杂微生物环境的竞争压力，而VII型分泌系统（Type VII Secretion System, T7SS）被认为是介导细菌间竞争和宿主适应的关键武器。尽管已知T7SS能分泌多种效应蛋白，其中富含亮氨酸-X-甘氨酸（Leu-x-Gly, LXG）结构域的 polymorphic toxins 是其主要毒性因子，但LXG效应子的具体分泌机制及其在致病过程中的功能尚未完全阐明。

为了解决这一科学问题，南京农业大学Wu Huizhen等研究人员在《BMC Biology》上发表了题为"A LXG toxin stabilized by DUF4176 contributes to Streptococcus suis competition and pathogenicity"的研究论文。该研究通过系统分析猪链球菌中LXG效应子的多样性，聚焦于强毒株WUSS351中的LXG1-CT3毒素，揭示了其孔形成活性及在细菌竞争和感染中的关键作用，并首次发现DUF4176蛋白家族作为分子伴侣稳定相应LXG毒素，从而增强细菌竞争能力。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用系统发育分析鉴定猪链球菌LXG效应子的多样性与分类；通过细菌毒性实验（生长曲线和CFU计数）验证LXG毒素功能；采用细菌双杂交（BACTH）和Western blot分析蛋白相互作用；使用激光共聚焦显微镜（LSCM）和扫描电镜（SEM）观察膜损伤形态；通过小鼠感染模型评估细菌负载与生存率；借助荧光素酶报告系统（Rluc-Luciferase assay）检测T7SS依赖性分泌。

结果

猪链球菌中存在至少5种LXG结构域组和14种C末端毒素类型

通过对441条LXG相关序列的系统发育分析，研究人员将猪链球菌LXG效应子划分为LXG-1至LXG-5五个主要组别，其C末端毒素（CT）可分为14种类型（CT1-CT14）。毒性实验表明，多种CT类型（如CT1、CT2、CT6、CT10、CT11、CT13）在胞内表达时具有显著毒性，而CT3、CT8、CT12需定向至周质空间才能发挥毒性作用。

LXG1-CT3/Imm3构成毒素-免疫蛋白对

在WUSS351菌株中，LXG1-CT3与其下游的DUF443结构域蛋白（命名为Imm3）形成典型的毒素-免疫蛋白对。序列与结构分析显示LXG1-CT3与金黄色葡萄球菌TspA毒素具有相似性。表达实验证实LXG1-CT3在周质中具有毒性，而共表达Imm3可完全中和其毒性作用。

LXG1-CT3是T7SS介导细菌竞争的关键毒性效应子

基因敲除实验表明，缺失LXG1-CT3显著削弱WUSS351对敏感靶菌的竞争能力。进一步研究发现，LXG结构域和T7SS核心组件（esxA, esaA, essA, esaB, essB, essC）的缺失均导致竞争表型缺陷。通过荧光素酶报告系统证实LXG1-CT3的分泌依赖于T7SS机制。

LXG1-CT3通过孔形成作用破坏细胞膜

跨膜结构预测显示LXG1-CT3C末端含多个跨膜螺旋。通过SYTO9/PI染色和激光共聚焦显微镜观察，发现表达LXG1-CT3的大肠杆菌出现膜完整性破坏，而共表达Imm3则提供完全保护。扫描电镜进一步证实LXG1-CT3表达导致细胞皱缩、变形和孔洞形成。

T7SS和LXG1-CT3显著增强猪链球菌在小鼠感染模型中的毒力

小鼠感染实验表明，缺失T7SS核心组件（ΔT7SScc）或LXG1-CT3（ΔLXG1-CT3）的菌株在血液、脑、肾脏和肝脏中的细菌载量显著降低，且感染小鼠生存率提高。回补实验证实LXG1-CT3的缺失表型可被完全恢复。

DUF4176与LXG效应子存在遗传关联和功能特异性

基因组分析发现DUF4176蛋白家族特异性地与LXG-1、LXG-2和LXG-5效应子组相关联。系统发育分析将DUF4176分为8个组别，分别对应特定的CT毒素类型（如DUF4176^CT3对应CT3毒素）。细菌双杂交实验证明DUF4176与LXG效应子的中段预毒素（PT）结构域和毒素（CT）结构域均发生特异性相互作用。

DUF4176作为分子伴侣稳定相应效应子

Western blot分析显示，缺失DUF4176^CT3导致LXG1-CT3蛋白水平显著降低，而回补实验证实该功能具有特异性。细菌竞争实验进一步证明，只有同源DUF4176能够恢复菌株的竞争能力，非同源DUF4176则无此功能。

结论与意义

本研究系统阐明了猪链球菌中LXG效应子的多样性及其在细菌竞争和致病过程中的核心作用。主要创新发现包括：首次证实LXG1-CT3作为孔形成毒素通过T7SS系统分泌并介导接触依赖性竞争；发现DUF4176蛋白家族作为特异性分子伴侣，通过稳定LXG毒素前体增强细菌竞争力；证明T7SS和LXG1-CT3在体内感染模型中发挥关键毒力作用。

该研究不仅深化了对猪链球菌致病机制的理解，更重要的是揭示了T7SSb分泌LXG效应子的分子机制，为开发针对细菌分泌系统的抗菌策略提供了新思路。DUF4176作为毒素稳定剂的功能可能广泛存在于多种革兰氏阳性菌中，这一发现为研究细菌竞争机制提供了新的范式。