靶向BAFF与IL-17的双特异性单链抗体(bsscFv)的构建及其在系统性红斑狼疮治疗中的机制研究

本刊推荐：为解决系统性红斑狼疮(SLE)治疗中单一靶点疗效有限的问题，Xin等研究人员开展了靶向B细胞活化因子(BAFF)和白细胞介素17(IL-17)的双特异性单链抗体(bsscFv)的构建与功能研究。研究通过噬菌体展示技术筛选特异性scFv，构建能同时中和BAFF和IL-17的bsscFv，并在MRL/lpr小鼠模型中验证其治疗效能。结果显示bsscFv可显著降低自身抗体水平、蛋白尿和肾脏病理损伤，调控炎症因子表达，为SLE治疗提供了新型双靶点治疗策略。

　　

在自身免疫疾病的广阔战场上，系统性红斑狼疮(SLE)始终是免疫学家和临床医生面临的最棘手挑战之一。这种慢性自身免疫性疾病以机体产生大量自身抗体、免疫复合物沉积和多器官损伤为特征，犹如一场免疫系统的"内战"，导致皮肤、关节、肾脏等多个器官遭受攻击。尽管近年来对SLE发病机制的理解不断深入，但许多患者仍然承受着疾病带来的严重痛苦和高死亡率，迫切需要新的治疗策略。

SLE的发病机制涉及遗传、环境和免疫因素的复杂相互作用，其中B细胞活化因子(BAFF)和白细胞介素17(IL-17)被认为是两个关键"罪魁祸首"。BAFF作为肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，在B细胞存活、成熟和自身抗体产生中发挥核心作用；而IL-17则由辅助性T细胞17(Th17)产生，通过促进炎症反应、组织损伤和免疫细胞招募参与疾病进程。临床上，SLE患者血清和靶器官中BAFF和IL-17水平均显著升高，且与疾病活动度密切相关。

目前针对SLE的治疗方法存在明显局限性。BAFF靶向单抗如贝利尤单抗(belimumab)虽已获批用于SLE治疗，但对高疾病活动度或难治性患者效果有限；IL-17抑制剂在银屑病和强直性脊柱炎等自身免疫病中显示出潜力，但在SLE中的疗效仍在探索中。同时使用两种单抗的联合疗法虽然可能增强疾病控制效果，但会带来成本增加、复杂性提高、潜在毒性叠加和患者依从性下降等问题。

在这一背景下，双特异性抗体技术为SLE治疗提供了新思路。这类工程化抗体能够同时识别两种不同抗原，通过协同靶向多个疾病相关通路，有望实现增强的治疗效果和减少的副作用。Xin等研究人员在《BMC Biology》上发表的最新研究，正是基于这一理念，开发了一种同时靶向BAFF和IL-17的双特异性单链可变片段(bsscFv)，为SLE治疗提供了新的解决方案。

研究人员运用了几个关键技术方法：通过噬菌体展示技术从免疫小鼠脾细胞中筛选针对BAFF和IL-17的特异性单链抗体(scFv)；利用基因工程技术将两个scFv通过柔性连接肽(G₄S)₂连接构建bsscFv，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化；采用体外细胞实验评估bsscFv对BAFF诱导的Raji细胞增殖和IL-17诱导的HT-29细胞CXCL1分泌的抑制能力；使用MRL/lpr小鼠模型(10-12周龄雌性，每组5只)进行体内药效学评价；通过转录组学和代谢组学分析探讨治疗机制。

Protein expression and purification

研究人员首先在原核系统中成功表达并纯化了重组人BAFF和IL-17蛋白。SDS-PAGE显示在预期分子量位置(BAFF为18 kDa，IL-17为16 kDa)出现单一条带，纯度超过95%。Western blot使用抗His抗体进一步验证了蛋白身份。

Antibody titers and spleen cell isolation

用重组BAFF和IL-17蛋白免疫小鼠后，抗原特异性抗体效价显著升高。第四次免疫后，抗BAFF和抗IL-17抗体的终点效价分别达到1:204,800和1:102,400。脾细胞分离后存活率超过90%，为抗体库构建提供了高质量材料。

PCR of antibody chains and construction of scFv phage library

从脾细胞中提取总RNA并合成cDNA，PCR扩增获得约400 bp的轻链(V_L)和500 bp的重链(V_H)可变区片段。将纯化的V_L和V_H片段克隆到pCANTAB 5E载体中，构建了容量为1.05×10¹¹独立克隆的噬菌体库。PCR筛选显示超过93%的克隆含有预期大小的插入片段。

Phage display selection

经过五轮噬菌体展示筛选 against 重组BAFF和IL-17蛋白，通过噬菌体ELISA筛选到两个独特的scFv克隆：scFv1和scFv2，分别特异性结合BAFF和IL-17。

Construction and expression of bsscFv

将scFv1和scFv2序列通过柔性连接肽(G₄S)₂融合构建bsscFv(图1A)。将bsscFv基因克隆到pET28a(+)载体中，转染BL21(DE3)细胞进行蛋白表达。通过亲和色谱从破碎细胞裂解液中纯化蛋白，SDS-PAGE和Western blot验证了纯化蛋白(图1B、C)。

In vitro experiments

在体外实验中，bsscFv表现出强大的双中和活性。BAFF促进Raji细胞增殖(图2A)，IL-17诱导HT-29细胞分泌CXCL1(图2B)。bsscFv能抑制BAFF诱导的Raji细胞增殖和IL-17介导的CXCL1分泌。重要的是，IL-17不影响bsscFv对Raji细胞增殖的抑制(图2C)，BAFF也不影响其对CXCL1分泌的抑制(图2D)。bsscFv对Raji细胞增殖的IC₅₀为0.39±0.04 nM，与scFv1(0.43±0.02 nM)相似；对HT-29细胞的IC₅₀为4.63±0.35 nM，与scFv2(4.12±0.19 nM)相当。

In vivo experiments

体内实验显示，单次注射scFv1/bsscFv显著降低小鼠脾脏中CD19转录水平(图2E)，表明有效中和了BAFF。同样，scFv2/bsscFv注射显著降低小鼠CXCL1水平(图2F)，证明有效拮抗了IL-17。

PK/PD

药代动力学(PK)分析显示，bsscFv在小鼠中表现出非线性行为，血清浓度呈剂量依赖性下降。曲线下面积(AUC_0-∞)随剂量增加而不成比例增加，终末半衰期从3天延长至8天，这可能通过BAFF介导的靶向消除有关。皮下注射生物利用度为93%，注射后3天达到峰值浓度。结合试验证实了bsscFv的功能完整性且未产生抗药物抗体(图2G)。bsscFv给药后，血清中BAFF和IL-17水平均呈剂量依赖性调节，反映了抗体的药效学(PD)效应(图2H、I)。PD分析显示循环B细胞呈剂量依赖性减少，5 mg/kg注射2个月后抑制率达50%~60%(图2J)，证实了BAFF中和作用和bsscFv的生物活性。

Influence of bsscFv treatment on cytokine levels and correlation with target distribution in MRL/lpr mice

如图3I所示，bsscFv治疗后小鼠外周血单核细胞中Il-2、Il-4、Il-6、Il-10、Ifnα、Tnfα和Cd83的表达水平下调。图3J和K表明，bsscFv治疗导致肾组织中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α和TNF-α蛋白水平显著降低。

Effect of bsscFv treatment on urinary protein and autoantibody levels in MRL/lpr mice

将小鼠分为五组：BALB/c对照组(n=5)、MRL/lpr模型组(n=5)以及低(1 mg/kg，n=5)、中(5 mg/kg，n=5)、高(10 mg/kg，n=5)剂量bsscFv治疗的MRL/lpr模型组，腹腔注射给药，每周两次，持续8周。如图3A-H所示，中、高剂量组尿蛋白水平显著降低。血尿素氮(BUN)水平也呈剂量依赖性下降。bsscFv治疗组抗双链DNA抗体水平、血清肌酐(Scr)、抗核抗体(ANA)、抗snRNP/Sm抗体和SLE-IgG水平较低。中、高剂量组尿蛋白/肌酐比值显著降低。

Histopathological improvements and reduced immune complex deposition in bsscFv-treated MRL/lpr mice

图4A-C显示，HE、PAS和Masson三色染色显示bsscFv治疗组肾脏病理改善，肾小球和肾小管间质病变减少。HE染色中，黄色箭头指向肾小球，红色箭头指向肾小管，黑色箭头指向间质区域。MRL/lpr对照组显示肾小管上皮松散、水肿和脱落。然而治疗组显示保存完好、圆形的肾小管上皮细胞和有序的刷状缘，证实了治疗的有效性。PAS和Masson三色染色进一步证实治疗组肾脏病理显著改善。如图4D和E所示，bsscFv治疗组肾脏中免疫复合物沉积显著减少，进一步支持了治疗效果。

Transcriptomic and metabolomic analyses reveal therapeutic effects of bsscFv treatment in MRL/lpr mice

对MRL/lpr模型组(M)和双特异性抗体治疗组(T)肾脏的转录组和代谢组分析显示，bsscFv靶向免疫反应和代谢通路。GO富集分析显示免疫相关过程如对刺激的反应上调，表明免疫防御改善和自身免疫损伤减少。与适应性免疫和调控相关的富集基因表明病理免疫反应减少。吞噬泡和免疫球蛋白复合物等细胞成分表明吞噬作用和抗体介导的免疫力增强，可能减轻肾脏损伤(图5A)。KEGG通路分析突出显示了代谢通路，如过氧化物酶体、吞噬体和脂肪酸降解，表明氧化应激和炎症减少。脂质代谢调控，特别是不饱和脂肪酸生物合成，表明免受脂质过氧化和肾脏损伤的保护作用(图5B)。代谢组聚类分析显示治疗组中代谢物如(4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3(4H)-基)乙酸和抗炎化合物(倍氯米松、氟氢缩松)水平较高(图5C)。KEGG热图分析显示核苷酸和脂质代谢变化，表明bsscFv减少了与脂质紊乱相关的代谢失衡和肾脏损伤(图5D)。

Analysis of antigen-antibody binding sites

使用AlphaFold预测bsscFv的三维结构。BAFF(PDB ID：1KD7)和IL-17(PDB ID：4HR9)的结构使用Discovery Studio预处理并在PyMOL中可视化。相互作用如图Additional file 1：Fig. S6D所示，bsscFv显示为绿色，BAFF为蓝色，IL-17为紫色。黄色虚线表示氢键，红色虚线表示疏水相互作用。bsscFv-BAFF和bsscFv-IL-17的结合得分分别为-295.89和-288.00，置信度为94%，表明结合稳定性强。关键相互作用包括BAFF的MET236/THR239与bsscFv的TYR176/TYR103之间的氢键(3.1 ?，3.0 ?)。对于IL-17，ASN25与bsscFv的THR320形成氢键(2.7 ?)，IL-17的ARG20与bsscFv的TYR363、ASN365和TYR367形成三个氢键(2.3 ?，2.5 ?，3.1 ?)。这些相互作用对bsscFv、BAFF和IL-17蛋白之间的稳定结合至关重要。

Survival analysis of mice during the experimental period

Kaplan-Meier生存分析评估了所有体内实验组中小鼠的死亡率。在整个治疗期间，所有组均监测生存情况，未观察到任何队列中因治疗相关毒性或疾病进展导致的死亡。使用log-rank(Mantel-Cox)检验的统计分析显示各组间存活率无显著差异(P>0.05)。这些发现表明，双特异性抗体在所有测试剂量和实验条件下的给药均未对生存产生不利影响，且在体内耐受性良好。

本研究成功构建并表征了靶向BAFF和IL-17的bsscFv抗体，这两种细胞因子在SLE发病机制中起着关键作用。bsscFv对两个靶标均表现出强大的结合亲和力，且交叉干扰极小，在体外有效中和了BAFF和IL-17介导的生物活性。在MRL/lpr小鼠体内给药bsscFv导致自身抗体水平、蛋白尿、肾脏病理学和炎症细胞因子表达显著降低，伴随组织病理学改善和肾脏组织中免疫复合物沉积减少。药代动力学和药效学分析证实了其良好的生物利用度、生物活性和无 observable 毒性。多组学分析进一步支持bsscFv对免疫调节和代谢重新平衡的治疗影响。

综上所述，这些结果表明bsscFv是治疗SLE的有前景的双特异性治疗候选物，值得进一步的临床前和临床开发。与当前治疗策略相比，bsscFv具有几个潜在优势：它将双重特异性整合到单个分子实体中，可能实现更高效的免疫调节、有利的药代动力学、减少的给药频率和更好的患者依从性。此外，双特异性抗体已显示出超过单一疗法或其组合的协同效应，可能通过同时参与空间或时间上连接的免疫机制来实现。

然而，这项研究也存在局限性：治疗效力仅在单一小鼠模型中评估，bsscFv的细胞选择性尚未完全表征。虽然明确证明了细胞因子抑制和疾病改善，但未直接评估对自身反应性与非致病性淋巴细胞亚群的选择性靶向。未来的研究应纳入高分辨率分析方