基于HiFi reads的闭环式基因组大小精确估计算法LVgs的开发与应用

本研究针对K-mer基因组大小评估工具因参数选择导致的估算差异问题，利用HiFi reads的连续性和准确性优势，开发了闭环式基因组大小估算框架LVgs。该方法通过多K值循环预测获得稳态值，显著提升了二倍体、多倍体和大基因组物种的评估准确性，为属级超级泛基因组研究提供了可靠工具。

　　

在基因组学研究中，准确估计基因组大小（Genome Size, GS）是理解物种进化、功能基因分化以及开展高质量基因组组装的重要前提。尽管K-mer分析方法被广泛应用于评估基因组大小并指导组装过程，但不同工具和参数选择会导致结果存在显著差异，这给属级水平的基因组研究带来了巨大挑战。特别是在经历全基因组复制（Whole Genome Duplication, WGD）或具有高重复序列、高杂合性的复杂基因组中，传统方法往往表现不佳。

为了解决这一问题，来自海南大学、哥伦比亚大学等机构的研究人员合作在《BMC Genomics》上发表了一项研究，提出了一种基于HiFi reads的闭环式基因组大小精确估算方法，并开发了高效流程LVgs（https://github.com/xingjianfeng100/LVgs）。该方法不仅克服了单次K-mer预测的不稳定性，还能有效应用于二倍体、多倍体以及超大基因组的分析中，为属级物种的比较基因组学研究提供了新思路。

在方法上，本研究主要依托以下几项关键技术：首先利用PacBio HiFi reads获取高质量长读长序列；通过FastK进行K-mer计数与谱线分析；采用GenomeScope 2.0进行模型拟合与基因组大小预测；并引入hifiasm对原始读数进行纠错以提升数据准确性。此外，研究还整合了自定义Shell与R脚本实现多K值循环预测与稳态值筛选，使用Dickey-Fuller检验评估曲线收敛性。部分分析还涉及Illumina数据比对以及内部共线性区块的鉴定。

研究结果部分主要包括以下内容：

K value在重复序列和杂合性检测中的敏感性权衡

研究人员通过比较经历和不经历WGD的物种K-mer谱发现，较短的K-mer更易检测基因组中的重复特征，而较长的K-mer则有助于识别杂合性区域。在人类和二倍体拟南芥中，低K值谱中观察到的“多倍体特征”实际上源于古代WGD遗留的共线性区块，这一发现为WGD检测提供了新的生物信息学依据。

循环预测中的准确评估与突然崩溃共存

通过构建K-mer长度自17至577的递增预测循环，研究发现，在K值较小时GS估计波动较大，而当K达到77以上时结果趋于稳定。然而当K超过一定阈值（如427）时，由于错误K-mer与杂合性K-mer的频谱重叠，会导致GS预测值出现崩溃性下降，仅能获得实际值的一半左右。

多因素影响下耐受崩溃的迭代预测稳健框架

通过优化读数准确性（使用hifiasm重新校正）和提高测序深度，可有效推迟崩溃的发生并提升极限值的准确性。研究表明，LVgs在不同测序深度和基因组类型的分析中均表现出良好的稳健性与容错能力。

LVgs在纯合二倍体生物中的表现

即使对于高度纯合的基因组（如人类CHM13），GenomeScope 2.0仍可能错误地将部分杂合峰视为错误K-mer，导致预测值降至实际值一半。研究提出一种“单倍体模拟”方法（设置-p 1），有效避免崩溃，并获得接近T2T组装大小的极限值。

LVgs在复杂基因组中的性能

研究将LVgs应用于多种复杂基因组，包括三类葱属植物（基因组大小超过10 Gb）、同源三倍体香蕉、同源四倍体马铃薯以及异源四倍体百子莲。评估结果与流式细胞术和组装大小的一致性较高（偏差1-6%），显著优于其他K-mer分析方法。

研究表明，基于多K值循环预测与稳态值计算的LVgs流程，能够显著提高基因组大小估计的准确性与稳健性，特别适用于具有高重复性、高杂合度及多倍体特性的物种。该工具不仅为属级进化研究和大规模泛基因组分析提供了方法学支持，也为未来开发更复杂的K-mer分析策略（如WGD检测、多倍体分型等）奠定了理论基础。该方法的高度自动化和兼容性也使其能够灵活适配未来更新的生物信息学工具和算法。

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