整合WGCNA与ceRNA网络解析牛肌内脂肪沉积的circRNA调控新机制

本研究针对牛肌内脂肪(IMF)沉积分子机制不明的难题，通过整合加权基因共表达网络分析(WGCNA)和竞争性内源RNA(ceRNA)网络构建，揭示了杂交和牛肌肉组织中172个差异表达环状RNA(circRNA)的调控作用。研究发现circRNA通过吸附miRNA调控脂代谢关键基因(如EZH2、AKT3)，影响磷脂酰肌醇代谢和cGMP-PKG信号通路，为牛肉品质改良提供了新型分子靶标和育种策略。

　　

当我们品尝一块雪花均匀分布的和牛牛排时，那入口即化的口感背后，隐藏着动物育种学家们持续探索的科学奥秘——肌内脂肪(Intramuscular Fat, IMF)沉积。这种镶嵌在肌肉纤维间的脂肪组织，不仅是决定牛肉嫩度、风味和多汁性的关键指标，更是高档牛肉产品的核心品质标志。尽管日本和牛以其卓越的肌内脂肪沉积能力闻名于世，但通过杂交育种将这种特性导入其他品种（如中国的秦川牛）时，其分子调控机制却始终笼罩在迷雾之中。

传统研究多聚焦于信使RNA(mRNA)和微RNA(miRNA)的调控作用，而近年来发现的环状RNA(circular RNA, circRNA)因其特殊的共价闭合结构和高度稳定性，已成为调控脂肪代谢的新星。这些circRNA能够像海绵一样吸附miRNA，解除其对靶基因的抑制，从而影响脂肪细胞分化和脂质积累。在牦牛和水牛中，circPPARG1、circCWC22等已被证实能通过ceRNA机制调控IMF沉积，但在杂交和牛中，circRNA的调控网络仍属未知领域。

为了解开这个谜团，宁夏大学动物科学技术学院康小龙教授团队在《BMC Genomics》发表了创新性研究。他们通过整合多维组学数据，首次构建了杂交和牛肌内脂肪沉积的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，不仅发现了172个关键差异表达circRNA，更揭示了它们通过磷脂酰肌醇代谢和cGMP-PKG信号通路调控脂质合成的分子机制。这项研究为牛肉品质分子育种提供了新的理论依据和候选靶点。

研究人员采用的主要技术方法包括：采集30头杂交和牛（秦川牛×和牛）背最长肌样本，通过索氏提取法测定IMF含量并筛选高/低IMF组各3例；使用Illumina NovaSeq 6000平台进行circRNA测序，经RNase R处理富集circRNA并通过find_circ软件鉴定；利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与IMF性状相关模块；整合课题组已有miRNA和mRNA数据构建ceRNA网络；采用STRING数据库和Cytoscape进行蛋白质互作(PPI)网络分析；通过RT-qPCR验证测序结果可靠性。

差异表达circRNA的鉴定与特征分析

通过对高/低IMF组背最长肌样本的circRNA测序，共鉴定到10,382个circRNA，其中172个存在显著差异表达（89个上调，83个下调）。这些circRNA主要来源于外显子区域（annot_exons），长度集中在300-400bp。染色体分布分析显示2号染色体携带circRNA数量最多（937个），25号染色体最少（190个）。

circRNA来源基因的功能富集分析

对差异circRNA的158个宿主基因进行功能注释发现，这些基因显著富集于细胞过程、代谢调节等生物过程，以及磷脂酰肌醇代谢、cGMP-PKG信号通路等脂代谢相关通路。其中cGMP-PKG通路可通过激活蛋白激酶G促进脂肪酸氧化，而磷脂酰肌醇代谢则通过肌醇磷酸衍生物调控脂肪细胞分化。

蛋白质互作网络与关键基因筛选

通过STRING数据库构建PPI网络，从中筛选出72个核心节点基因。拓扑分析识别出EZH2、AKT3、APP、SMARCA5等关键基因，这些基因在脂肪代谢中发挥重要作用：EZH2通过组蛋白甲基化调控脂质合成基因；AKT3通过WNK1/SGK1信号轴抑制脂肪生成；APP在肥胖个体脂肪组织中高表达；SMARCA5则与Werner综合征蛋白互作调控脂肪分化。

共表达网络模块与IMF性状关联

WGCNA分析识别出10个基因共表达模块，其中蓝色模块(MEblue)和黑色模块(MEblack)与IMF含量显著相关。蓝色模块的158个基因富集于肌动蛋白细胞骨架组织、脂质结合等过程，以及β-丙氨酸代谢、醛固酮合成分泌等通路；黑色模块的58个基因则与成纤维细胞迁移、胰岛素抵抗等过程相关。

ceRNA调控网络的构建与验证

通过整合circRNA、miRNA和mRNA表达数据，构建了包含207个差异表达基因、70个circRNA和57个miRNA的ceRNA网络。发现novel_circ_009207通过吸附bta-miR-150调控NFIC基因，而novel_circ_001732等4个circRNA通过bta-miR-204调控NFIC和CKRL基因。NFIC作为转录因子，可通过Wnt信号通路调控脂肪细胞分化平衡。

实验验证与数据可靠性

随机选择5个差异circRNA进行RT-qPCR验证，结果显示测序数据与实验数据高度一致（相关系数0.99），证实了circRNA鉴定结果的可靠性。

这项研究通过多组学整合分析，首次系统揭示了杂交和牛肌内脂肪沉积的circRNA调控网络。研究发现circRNA通过ceRNA机制吸附miRNA，解除其对NFIC等关键转录因子的抑制，进而通过磷脂酰肌醇代谢和cGMP-PKG信号通路调控脂质合成。鉴定出的EZH2、AKT3、APP等核心基因为理解脂肪代谢提供了新视角。

研究的创新点在于将WGCNA与ceRNA分析相结合，从系统生物学角度解析了circRNA的调控功能。发现的novel_circ_009207-bta-miR-150-NFIC等调控轴，为分子育种提供了潜在靶点。此外，研究提示circRNA可能作为新型分子标记用于牛肉品质选育，这对提升我国肉牛产业竞争力具有重要意义。

值得注意的是，本研究发现的circRNA调控机制与已知的Wnt、MAPK、AMPK等经典脂肪代谢通路存在差异，这可能反映了物种特异性调控机制。未来需要扩大样本规模并进行功能验证实验，如基因敲除、过表达和双荧光素酶报告基因检测，以证实这些circRNA的分子海绵功能及其对脂肪沉积的具体影响。

总之，这项研究不仅深化了对牛肌内脂肪沉积分子机制的理解，更为精准育种提供了新的候选靶点和理论依据。随着后续功能研究的深入，这些发现有望转化为实际育种应用，推动优质肉牛品种的培育和牛肉品质的提升。