NR2E1基因启动子区甲基化调控肉牛脂肪沉积的功能机制研究

本研究针对肉牛育种中肉质性状遗传标记稀缺的问题，聚焦NR2E1基因启动子区CpG岛甲基化对脂肪沉积的调控机制。通过对比三个肉牛品种（和牛、固原牛、中国西门塔尔牛）的甲基化水平与转录组数据，发现甲基化程度与基因表达呈负相关。功能实验表明，干扰NR2E1可抑制脂肪细胞增殖（下调CDK1、CCND1等基因）、分化（下调PPARγ、CEBPβ等基因）并促进凋亡（调控BAD/BCL2），而过表达则激活AKT通路。该研究为肉牛脂肪沉积的分子调控提供了新靶点，对品种选育具有重要意义。

　　

在肉牛育种领域，脂肪沉积是影响肉质风味和经济效益的关键性状，但其分子调控机制尚未完全阐明。遗传标记稀缺和功能基因研究不足严重制约了优良品种选育和新品系开发。近年来，表观遗传调控尤其是DNA甲基化被认为在基因表达调控中扮演核心角色——启动子区CpG岛的甲基化通常导致基因转录抑制。NR2E1（又称TLX）作为孤儿核受体家族成员，既往研究提示其可能参与脂肪代谢调控：NR2E1缺失小鼠表现出葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和脂肪组织炎症，且体重和脂肪量显著降低。在牛中，Ramayo-Caldas等发现该基因与肌内脂肪沉积相关，但其在牛脂肪细胞中的具体功能及甲基化调控机制仍属空白。

为填补这一研究缺口，Feng等人在《BMC Genomics》发表了最新成果，系统解析了NR2E1基因启动子甲基化在三个肉牛品种（和牛、固原牛、中国西门塔尔牛）中的差异及其对脂肪细胞生物学行为的调控作用。研究人员首先通过亚硫酸盐测序（BSP）分析皮下脂肪组织NR2E1启动子区10个CpG位点的甲基化水平，发现和牛甲基化率最高（24.1%），固原牛次之（13.7%），中国西门塔尔牛最低（11.5%），且与RNA-seq数据呈负相关。随后以固原牛为模型，通过体外干扰（siRNA）和过表达（pcDNA3.1载体）NR2E1，结合qRT-PCR、CCK-8、EdU、流式细胞术、油红/Oil Red O/BODIPY/Nile Red染色、甘油三酯（TG）检测及Western blot等技术，深入探究了该基因对前体脂肪细胞增殖、分化、凋亡及下游信号通路的影响。

NR2E1基因CpG岛测序

通过PCR扩增和T/A克隆测序，发现NR2E1启动子区存在9个CpG位点。三个品种的甲基化水平差异显著，且与转录组表达呈负相关，提示甲基化可能抑制NR2E1转录。

前体脂肪细胞诱导分化模型的构建

采用组织块法成功分离固原牛前体脂肪细胞，经诱导分化6天后，油红O和BODIPY染色显示脂滴积累显著增加（P<0.01），分化标志基因PPARγ和CEBPβ表达上调（P<0.01）。NR2E1在分化过程中表达逐渐升高，第6天达峰值（P<0.01），证实其参与分化调控。

NR2E1基因调控脂肪细胞增殖、分化和凋亡的研究

筛选出高效干扰片段si-NR2E1-835（P<0.01）并成功构建过表达载体。干扰NR2E1后：

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  增殖标志基因（CDK1、CCND1、PCNA、CCNA2）下调（P<0.01）；
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  EdU和CCK-8显示细胞增殖率降低（P<0.01）；
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  流式细胞术表明S期细胞减少，G1/S期阻滞；
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  分化标志基因（PPARγ、CEBPβ、FABP4、LPL）下调（P<0.01）；
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  脂滴染色（BODIPY、Oil Red O、Nile Red）和TG含量测定显示分化受阻（P<0.01）；
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  凋亡实验显示早期/晚期凋亡增加，促凋亡基因BAD上调而抑凋亡基因BCL2下调（P<0.01）。
  过表达NR2E1则呈现相反效应。

NR2E1基因抑制牛脂肪细胞AKT信号通路

Western blot表明干扰NR2E1后AKT磷酸化水平升高（P<0.01），而过表达NR2E1抑制AKT通路（P<0.01），提示NR2E1可能通过PI3K/AKT通路参与胰岛素信号调控。

本研究首次揭示NR2E1启动子甲基化水平具有品种特异性，且与表达负相关；功能上证实NR2E1促进脂肪细胞增殖和分化、抑制凋亡，并调控AKT信号通路。这些发现不仅深化了对肉牛脂肪沉积表观遗传调控的理解，也为分子育种提供了潜在靶点——通过调控NR2E1甲基化状态可能改善脂肪沉积和肉质性状，具有重要的理论和应用价值。