小麦DOG基因家族的进化与功能分化及其在种子休眠调控中的关键作用

本研究系统鉴定了小麦53个TaDOG基因家族成员，通过多组学分析揭示其通过片段重复扩张的进化机制及激素响应特性。研究发现TaDOG3与穗发芽率（PHS）呈负相关，可作为抗PHS育种的潜在分子标记，为小麦抗穗发芽育种提供了理论依据和靶点基因。

　　

背景

种子萌发是植物从休眠状态转向活跃生长的关键发育过程，对植物生存和农业生产力至关重要。该过程受到环境因素（温度、湿度、光照）和内源信号的精密调控，其中激素途径——特别是脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）——发挥核心作用。在拟南芥等模式植物中，遗传学研究已鉴定出众多调控种子休眠和萌发的关键因子，包括转录因子、激素信号组分和结构蛋白。其中，发芽延迟1（DOG1）基因作为控制种子休眠的主要数量性状位点（QTL）首先在拟南芥中被发现，DOG1突变会导致休眠减弱和提前萌发。DOG1与新鲜收获种子的休眠程度密切相关。

DOG1的发现和功能研究被视为种子休眠研究的重大突破。拟南芥基因组中含有五个DOG1-like基因（DOGL1~5），其中DOGL1~4位于4号染色体且彼此相邻，DOGL5位于3号染色体。DOGL1、DOGL2和DOGL3的氨基酸序列与DOG1相对相似，而DOGL4和DOGL5与DOG1的相似性仅分别为28%和30%。在所研究的双子叶植物中，DOG1之间的氨基酸序列相似性较高。迄今为止，DOG1基因已在多种植物物种中被鉴定，包括普通小麦（Triticum aestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon (L.) P. Beauv）。通常，DOG1基因的表达水平越高，种子休眠程度越深，它是种子休眠的重要调控因子。水稻中的OsDOG1L-3是拟南芥DOG1的同源基因；在水稻中过表达或引入OsDOG1L-3等位基因会增强种子休眠，OsDOG1L-3表达与种子休眠呈正相关。TaDOG1L1可诱导小麦种子休眠，但其与拟南芥DOG1的序列相似性较低，表明DOG1的特异性表达模式在不同植物中并不保守。在拟南芥中，分别异位过表达TaDOG1L1和TaDOG1L4均显著增加种子休眠，且干种子储存期间的休眠释放与过表达DOG1的转基因植物相似。这表明这些DOG1-like蛋白在增强种子休眠方面具有保守功能。此外，在小麦中过表达TaDOG1L4导致种子休眠程度加深，而通过RNAi沉默TaDOG1L4则导致种子休眠减弱。

种子休眠受到植物激素网络和遗传决定子的复杂调控。至今，已在此调控背景中鉴定和表征了九种主要植物激素，包括脱落酸（ABA）、生长素（IAA）、油菜素内酯（BR）、细胞分裂素（CK）、乙烯（ET）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和独脚金内酯（SL）。其中，ABA和MeJA是调控种子休眠的两个最关键植物激素，ABA和MeJA之间的动态平衡是控制种子休眠维持和萌发启动的调控网络的核心。尽管少数报道显示MeJA在调控种子休眠中的作用，但JA与ABA协同抑制种子萌发。DOG1基因作为负调控因子，通过ABA途径改变内源激素平衡来调控种子休眠。现有研究表明，外源施用ABA促进DOG1基因表达，增加种子对ABA的敏感性，从而促进种子休眠。

小麦（T. aestivum）是一种异源六倍体（AABBDD）谷物作物，具有巨大且复杂的基因组（约17 Gb），这使得全基因组基因家族分析具有挑战性，但对于理解其农艺性状至关重要。目前，已在小麦中定位了数个与种子休眠和穗发芽（PHS）相关的QTLs，然而这些性状背后的分子机制，特别是关于小麦DOG基因家族的部分，仍知之甚少。DOG1基因与种子休眠高度相关。然而，小麦DOG基因家族的特征、表达模式，及其响应外源激素和调控种子休眠的分子机制尚未完全阐明。

材料与方法

研究使用小麦（T. aestivum cv. Chinese Spring）品种。种子在22°C黑暗条件下的湿润滤纸上萌发。幼苗在生长室中培养，条件为16小时光照/8小时黑暗循环，60%湿度，23°C温度。收取不同组织（根、茎、叶、穗和开花期的发育籽粒），液氮速冻后于-80°C保存用于RNA提取。

小麦DOG基因的全基因组鉴定基于小麦参考基因组（IWGSC RefSeq v1.1）和蛋白质序列（从EnsemblPlants数据库下载）。使用拟南芥DOG1蛋白序列（AT5G45830）作为查询，对小麦蛋白质组进行BLASTP搜索（E值<1e-10）。同时，使用HMMER 3.0软件，利用DOG1的保守结构域（从Pfam数据库获取，PF14144）进行隐马尔可夫模型（HMM）搜索。通过95%同一性聚类去除冗余序列，并使用CDD和SMART在线工具验证候选基因的保守结构域。

系统发育和序列分析使用MEGA v7软件对小麦、拟南芥、水稻和玉米的DOG全长蛋白序列进行比对。采用最大似然法（ML）构建系统发育树，bootstrap重复1000次，使用泊松模型。使用MEME在线工具识别保守基序，参数设置为发现10个基序，长度范围6至50个氨基酸。使用TBtools软件通过比对DNA序列进行基因结构分析。

顺式作用元件预测提取了小麦DOG基因启动子区域（转录起始位点上游2 kb），并使用PlantCARE在线工具预测顺式作用元件。注释并可视化与激素响应（ABA、MeJA、生长素等）、胁迫响应（干旱、寒冷、盐）和发育调控相关的元件。

基因组共线性分析使用Circos软件将所有小麦DOG基因定位到染色体上。使用MCScanX软件（默认参数）分析小麦DOG基因的基因组内共线性。识别共线性基因对，并对重复类型（片段、串联或分散）进行分类。通过BLASTP（E值<1e-5）进行小麦与拟南芥/水稻/玉米之间的同线性分析，并使用Multiple Systeny Plot软件进行可视化。

表达模式分析从小麦表达浏览器（Wheat Expression Browser）获取不同小麦组织（根、茎、叶、穗和发育籽粒）的RNA-seq数据。基因表达水平通过每百万转录本数（TPM）值量化。使用三叶期幼苗（小麦播种后第45天）、根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、穗和开花期籽粒（小麦播种后第215天）的中国春材料进行RT-PCR验证。

对于激素处理实验，对7天龄幼苗喷洒100 μM MeJA或100 μM ABA，并在0、3、6、12和24小时收集叶片样品。使用TRIzol试剂提取总RNA，反转录成cDNA，并在实时系统（Bio-Rad）上使用SYBR Green Master Mix进行RT-PCR。以小麦Actin基因作为内参，使用2^?ΔΔCT方法计算相对表达量。所有引物使用Primer Premier 5.0软件设计。

穗发芽试验与验证选择了四个中国冬小麦品种，在2022-2023年度种植于商丘市农林科学院双八镇试验基地。采用随机区组设计，3个生物学重复。在小麦成熟前期（收获前7至10天），从每个品种的三个重复小区中各选取10个饱满无病麦穗进行PHS试验。完成后，记录发芽籽粒的表型并计算发芽率。在灌浆后期（花后25天），从每个品种的三个重复小区中取穗中部籽粒，立即投入液氮速冻用于RNA提取，检测与PHS相关的标记基因表达变化。

结果

小麦DOG基因家族成员的鉴定

在小麦基因组中共鉴定出53个DOG基因家族成员，命名为TaDOG1至TaDOG53。序列分析显示，TaDOG蛋白长度在198至580个氨基酸之间，分子量为21.66至62.92 kDa，等电点（pI）在5.24至10.37之间。所有成员均包含保守的DOG1结构域（PF14144）。染色体定位显示这些基因不均匀分布在所有21条小麦染色体上，其中3号染色体包含最多基因（15个）。

DOG基因的系统发育分析

利用小麦、拟南芥、水稻和玉米的DOG蛋白构建的系统发育树解析为三个主要分支（Group I - Group III），并得到高bootstrap值（>70%）的支持。每个组都包含来自四个物种的DOG基因家族成员。其中，Group I包含更多的DOG蛋白。蛋白质序列聚类表明，同一组内的DOG基因家族成员高度相似，暗示它们具有相似的功能和进化过程。与拟南芥相比，小麦DOG基因家族成员与水稻和玉米的关系更近。

基序和基因结构分析

根据系统发育分析的聚类结果，进行了基序和基因结构分析。MEME分析在DOG家族中鉴定出10个保守基序（Motifs 1~10）。Motif 1和4存在于所有成员中，对应于核心DOG1结构域，而其他基序则显示出组特异性分布。基因结构分析显示，TaDOG基因具有1~12个外显子，Group I成员通常包含8~12个外显子，而Group III中的TaDOG基因外显子较少（1~2个）。这种结构变异可能有助于功能特化。

顺式作用元件分析

启动子分析鉴定出大量与激素信号和胁迫响应相关的顺式作用元件。ABA响应元件（ABREs）在22.52%的TaDOG启动子中被发现，而MeJA响应元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）则存在于36.56%的启动子中。此外，水杨酸（TCA-element）和赤霉素响应性（TATC-box）元件分别存在于3.05%和0.53%的启动子中。与低温胁迫（LTR）、光胁迫（G-box、GT1-motif、ACE）、防御和胁迫响应性（TC-rich repeats）相关的元件也很丰富。这些发育调控元件暗示了其在种子发育中的潜在作用。

基因组共线性分析

基因组内共线性分析鉴定出124个片段重复事件，未发现小麦DOG基因之间存在串联重复事件。几乎所有片段重复都存在于同源染色体之间，并涉及小麦的所有21条染色体。这表明全基因组片段重复事件在小麦DOG基因扩张中起主要作用。

与拟南芥、玉米和水稻的三个比较同线性图谱显示，小麦与拟南芥、玉米和水稻分别存在0、70和72个直系同源基因对。TaDOGs与禾本科植物水稻和玉米具有更高的同线性关系。特别地，未发现小麦与拟南芥之间存在同线性关系。53个TaDOGs中的42个与19个水稻DOG基因存在同线性关系。类似地，53个TaDOGs中的46个与20个玉米DOG基因存在同线性关系。推测小麦、水稻和玉米等禾本科植物的DOG基因序列片段高度保守，它们具有更近的系统发育关系。此外，这些基因从古老的DOG同源基因进化而来。

TaDOGs在不同组织中的表达模式

RNA-seq分析显示，TaDOG基因在不同组织中表现出多样化的表达谱，这些数据源自8个不同的小麦器官/组织。聚类分析将这些TaDOG基因分为四个典型的表达簇。(1) 仅在特定组织中高表达或其表达水平在小麦发育过程中发生变化的TaDOGs，例如TaDOG3、TaDOG6和TaDOG9在籽粒中高表达，而TaDOG19在根中高表达。(2) 在小麦发育过程中大多数组织中均高表达的TaDOGs，例如TaDOG11、TaDOG14、TaDOG17、TaDOG13、TaDOG16和TaDOG18。这些基因可能在小麦发育过程中发挥基础重要作用。(3) 在小麦发育过程中所有组织中都表达，但表达水平相对较低的TaDOGs，例如TaDOG20、TaDOG25和TaDOG30。它们可能也在小麦发育过程中发挥基础作用。(4) 在小麦发育过程中所有组织中表达量极低的TaDOGs，例如TaDOG1、TaDOG4、TaDOG7、TaDOG34等。大多数TaDOGs属于此类，它们在各种器官发育中扮演重要角色。

由于大多数三基因的同源等位基因在小麦中表现出相似的表达水平，因此使用通用引物分析TaDOG同源等位基因的表达。通过RT-PCR验证了九个代表性DOG基因（包括TaDOG3、TaDOG11、TaDOG13、TaDOG19、TaDOG20、TaDOG22、TaDOG23、TaDOG40和TaDOG46）在不同小麦组织或器官中的基因表达水平。结果表明，这些基因在小麦不同组织或部位的表达趋势与RNA-seq中的数据一致。更重要的是，TaDOG3/6/9（包括其同源基因）表现出明显的组织特异性，并且在小麦籽粒发育中具有显著的高表达水平。推测其可作为检验种子休眠程度的标志基因。

MeJA和ABA处理下的激素响应表达

顺式作用元件分析表明，TaDOG基因的启动子区域存在许多激素响应相关的顺式元件，特别是与MeJA和ABA响应性相关的元件。

RT-PCR分析揭示了TaDOG基因响应MeJA处理的清晰动态表达变化。MeJA处理后，有9个基因在1小时时上调（>2倍）。其中，TaDOG4、TaDOG11和TaDOG23的表达在1小时时变化超过5倍。响应MeJA处理的DOG基因表达趋势大致可分为两类。一类是DOG基因的表达水平在12小时内呈现先升高后降低的趋势，包括TaDOG11/13/22/23/46。另一类是DOG基因的表达水平随着时间变化在12小时内持续上升，例如TaDOG3/19/20/40。ABA处理下的动态表达谱显示，不同的家族成员在ABA处理后表现出不同的时间表达模式。它在特定时间点（1小时、4小时和12小时）显著上调，显示出明显的早期响应模式。这些不同的表达动态表明TaDOG家族内部存在功能特化。这种时间调控的差异表明不同的TaDOG基因可能在不同阶段介导ABA信号传导，并可能通过互补或顺序的调控效应来协调发芽延迟。

TaDOG3表达与PHS率呈负相关

选择了四个遗传背景高度相似的小麦品种进行穗发芽试验，小麦的穗发芽表型存在显著差异。商农6号的PHS率长而密，整个穗的发芽程度最高（72.12%）。在商农9号中，穗粒发芽短而少，PHS率最低（31.03%）。商农5号和商农8号表现出中等的PHS率，分别为59.18%和53.19%。这些表型差异直接反映了品种间PHS率的差异。分别检测了不同小麦品种中TaDOG3的相对表达水平。结果表明，商农9号中TaDOG3的相对表达水平最高，商农6号最低。表达趋势与发芽率完全相反。这表明TaDOG3基因的表达水平与PHS率呈负相关。

讨论

TaDOG基因的进化扩张和结构分化

本研究系统鉴定了小麦DOG基因家族成员。同时，也鉴定了拟南芥、水稻和玉米的DOG基因家族成员。在六倍体小麦中鉴定出53个TaDOG基因，反映了与二倍体物种（如拟南芥中有19个AtDOG基因）相比，DOG1家族的显著扩张。这种扩张主要是由全基因组片段重复（124个事件）驱动的，这与小麦两次异源多倍体化的进化历史一致。结构分析揭示了外显子-内含子组织的显著差异。系统发育树中的Group I基因（8~12个外显子）可能编码具有复杂调控相互作用的多功能蛋白，而Group III基因（1~2个外显子）可能充当快速响应调节因子。这种结构复杂性可能为可变剪接创造大量机会，这是一种经过充分证明的机制，可通过从单个基因位点产生多个转录变体来产生蛋白质组多样性。与拟南芥DOG1基因类似，它通过可变剪接产生五种转录变体。Group I基因的复杂内含子区域可能通过为转录因子和顺式调控元件提供额外的结合位点来进一步增强调控灵活性，从而促进对波动环境条件的基因表达微调。与此形成鲜明对比的是，Group III TaDOG基因（1~2个外显子）的简化结构表明其作为快速响应调节因子的特殊作用。内含子较少的基因通常与更快的转录和翻译速率相关，因为最小化了pre-mRNA加工的要求。这种结构效率对于参与即时胁迫响应的基因特别有利，在这些情况下，快速的蛋白质合成对于适应性至关重要。这种多样化突显了DOG基因家族如何适应以满足精确的调控控制和环境响应性的双重需求，这对于小麦种子的生存和繁殖至关重要。所有成员中保守的基序（例如，Motif 1和4，核心DOG1结构域）证实了功能保守性，而组特异性基序（例如，Group I中的Motifs 1~7）则暗示了特殊作用。推测它们在TaDOG进化中发挥了根本重要作用。

不均匀的染色体分布（例如，3号染色体上有15个基因）和系统发育聚类为三个组意味着进化过程中的亚功能化。与水稻和玉米（分别有72和70个直系同源对）比与拟南芥（0对）更紧密的同线性关系，与单子叶植物-双子叶植物分化一致，支持了DOG基因在禾本科物种中的保守进化轨迹。启动子顺式元件富含ABA、MeJA和胁迫响应元件（例如，ABRE、CGTCA-motif），提供了TaDOG调控与环境信号之间的机制联系。MeJA响应元件（36.56%）和ABA响应元件（22.52%）的高频率与在这些激素下观察到的动态表达变化相关，表明TaDOG基因整合了多种信号通路。这些结果表明TaDOG基因家族积极响应外源激素处理。它可能通过调节种子对ABA或茉莉酸的敏感性来改变激素间的平衡，从而参与种子休眠和萌发的调控。

TaDOG基因的表达模式和生物学功能

基于RNA-seq的对八个小麦组织中TaDOG表达的解析，并经RT-PCR验证，揭示了复杂的功能分化。在植物中，基因表达模式与生物学作用紧密相关：普遍表达的基因通常支持基本过程，而组织特异性基因介导特殊功能。对于TaDOG基因，组织特异性表达谱表明TaDOG基因在小麦发育中具有多样化的作用。种子偏好性基因（例如，TaDOG3/6/9）可能在种子休眠和萌发中发挥作用，类似于拟南芥DOG1，而营养器官偏好性基因可能参与生长调控或胁迫适应。TaDOG3在小麦籽粒发育过程中的高表达表明其在维持种子休眠方面具有保守功能，可能减轻穗发芽。此外，根特异性TaDOG19可能介导根中ABA依赖性胁迫响应，因为ABA信号传导协调根结构和耐旱性。TaDOG11/14/17在大多数组织中高表达，暗示其具有看家或核心调控作用。在拟南芥中，一些DOG1-like基因是组成型表达的，并与多种信号通路相互作用。对于小麦，这些基因可能稳定基本发育过程（例如，细胞周期调控、激素稳态），这些过程在各个组织中都是必需的。它们在小麦三个亚基因组中的保守表达（通过同源等位基因表达一致性）进一步支持了它们的不可或缺性。一些DOG基因，如TaDOG20/25/30，广泛表达但水平较低，表明它们微调发育而不是驱动核心过程。在多倍体基因组中，这些基因通常源于亚功能化，其中重复基因分割了祖先功能。对于TaDOGs，低水平的普遍表达可能允许依赖性地响应环境线索（例如，温度、湿度），这与胁迫和激素信号相关的顺式元件一致。成簇基因（TaDOG1/4/7等）在所有组织中显示出可忽略的表达，这是多倍体基因家族中的一个常见特征。这些可能代表假基因，或者它们的表达可能由我们分析中未捕获的特定刺激诱导。或者，它们可能提供遗传冗余，这是多倍体驱动的对抗突变缓冲的标志。

值得注意的是，TaDOG3（及其同源等位基因）的籽粒特异性表达使其成为种子休眠的有前景的生物标志物。在拟南芥中，AtDOG1的表达水平与休眠深度相关，高表达延迟萌发。因此，可以量化小麦中TaDOG3基因的表达来预测小麦穗发芽的风险。

TaDOG基因的激素响应变化和功能特化

植物激素信号传导由复杂的顺式作用元件和转录因子网络 orchestrated。MeJA和ABA下的激素响应表达表明TaDOG基因被整合到复杂的调控网络中，可能介导胁迫和发育途径之间的交叉对话。TaDOG启动子中ABA响应元件（ABREs）和MeJA响应元件（CGTCA/TGACG）的富集提供了激素感知和转录激活之间的机制联系。

MeJA诱导的TaDOG表达分为“瞬时诱导降低”（如TaDOG11、TaDOG23）和“持续上调”（如TaDOG3、TaDOG19），这反映了TaDOG基因的功能特化。瞬时诱导基因可能介导早期信号传播：它们的快速峰值与MeJA在触发即时防御响应中的作用一致。相反，持续表达暗示长期生理调节的作用，例如在非生物胁迫下增强种子休眠以防止萌发。这种分化可能源于启动子区域活性元件的复杂性。这种调控表达模式的多样性反映了TaDOGs在进化过程中的不同适应性。ABA诱导的TaDOG表达模式揭示了休眠调控中的时间层次结构，包括早期（1-4小时）、瞬时（4小时峰值）和延迟（12小时）。早期响应者（例如，TaDOG13、TaDOG11）可能启动休眠：在拟南芥中，AtDOG1增强ABA敏感性以延迟萌发，它们的快速诱导表明其在将种子“锁定”进入休眠状态中的作用。瞬时响应者（例如，TaDOG23）充当“开关”，防止ABA信号的过度激活和潜在的发育停滞。延迟响应者（例如，TaDOG19、TaDOG46）可能通过表观遗传机制维持休眠。这种时间梯度反映了种子休眠（诱导、维持和释放）的顺序阶段，不同的TaDOGs控制每个阶段。这种精确性对小麦至关重要，因为错误调控的休眠会导致PHS，这是一个主要的产量限制因素。

TaDOG3可作为检测穗发芽程度的标志基因

PHS是小麦生产中的一种关键不利条件，导致产量损失和加工产品变质。在全球变暖的背景下，近年来小麦收获期间的降水频率增加，PHS风险进一步加剧。分析PHS的遗传机制对于育种抗性改良非常重要。本研究选择了四个遗传背景高度相似的小麦品种（杂交组合具有相同的父本或母本材料），有效消除了复杂遗传互作的干扰，更清晰地揭示了TaDOG3与PHS之间的关联。

在拟南芥中，DOG1是种子休眠的核心调控基因。它通过延迟萌发来增强休眠，其表达水平与休眠深度呈正相关。作为DOG1同源基因，小麦TaDOG3在四个品种中表现出“低PHS品种中高表达，高PHS品种中低表达”的模式，表明其保守地继承了“促进休眠、抑制萌发”的功能。在类似研究中，小麦TaDOG1-like基因也被证明与休眠显著相关。这进一步支持了TaDOG3参与PHS调控的假设。由于测试品种的遗传背景高度相似，表型差异更可能是由于TaDOG3表达调控的分化（例如启动子区域顺式元件的变异和转录因子结合的差异）所致，而不是复杂的遗传互作，这为后续的基因定位和功能验证奠定了基础。

种子休眠和萌发的核心是激素间的动态平衡：ABA促进休眠，GA促进萌发。TaDOG3高表达的小麦品种商农9号休眠强，PHS率低。推测它可能增强ABA信号（如促进ABA合成、抑制ABA降解）或抑制GA信号（如下调GA合成基因），从而延迟籽粒萌发。最新研究发现，小麦TaPP2C-a6与TaDOG1的相互作用通过调节ABA信号通路影响种子休眠。TaDOG3可能与TaPP2C-a6协同作用，形成ABA信号调控模块，进一步增强休眠。此外，拟南芥中的DOG1与磷酸酶AHG1/AHG3相互作用，抑制ABA信号的负调控因子，表明TaDOG3可能通过类似机制增强ABA敏感性并抑制萌发。

在本研究中，TaDOG3在遗传背景相似的品种间展示了稳定的“表达-表型”关联，为分子标记辅助育种提供了直接靶点。然而，应注意的是，TaDOG3的功能可能受环境因素调控。因此，需要进行基因型-环境互作研究，以阐明该基因在不同生态区的效应，避免分子标记的环境依赖性。

结论

本研究在小麦中鉴定出53个TaDOG基因，揭示了它们通过片段重复扩张的进化机制以及通过结构和表达分歧实现的功能分化。启动子顺式元件和激素响应性将TaDOGs与ABA/MeJA信号联系起来，而组织特异性表达，尤其是籽粒富集的TaDOG3，暗示了其在种子休眠调控中的作用。这些发现为验证TaDOGs在小麦休眠和胁迫适应中的功能奠定了基础，为旨在优化种子萌发性状的育种计划提供了潜在的遗传靶点。