高温与中温大曲的宏基因组学比较分析及江农酱香白酒发酵过程中微生物演替研究

本刊推荐：为解决混合大曲酿造江农酱香白酒过程中微生物群落调控机制不明的问题，研究人员通过宏基因组测序和理化分析开展了高温大曲(high-temperature Daqu)与中温大曲(medium-temperature Daqu)的比较研究。研究发现两种大曲在优势菌种、糖化力(saccharifying power)和蛋白酶活性(protease activity)方面存在显著差异，并揭示了发酵过程中从产酸菌群向耐酸耐乙醇菌群演替的规律。该研究为通过核心功能菌群调控提升白酒品质提供了理论依据。

　　

在中国白酒的酿造版图中，大曲作为糖化剂、发酵剂和原料，始终扮演着灵魂角色。根据发酵温度的不同，大曲可分为高温型、中温型和低温型，其中高温大曲的培菌温度可超过60°C，而中温大曲则在50-60°C之间。这些温度差异造就了不同的微生物生态系统，进而直接影响最终白酒的风味品质。然而，大曲的制备过程属于开放式环境，易受原料、工艺和环境波动的影响，导致其微生物群落结构不稳定，这成为制约白酒品质提升的关键技术瓶颈。

随着消费者对口感和健康需求的不断提升，采用混合大曲酿造复合风味白酒成为行业新趋势。江农酱香白酒(Jiang-Nong Jianxiang Baijiu)作为复合香型白酒的代表，兼具酱香和浓香白酒的特点，但其生产过程多依赖经验传承，缺乏科学的微生物调控指导。传统微生物培养技术虽能分离部分功能菌株，但难以全面解析复杂的微生物群落结构和功能基因表达情况。正是在这样的背景下，宏基因组学(metagenomics)技术为破解这一难题提供了全新途径。

近期发表在《BMC Genomics》的一项研究，通过宏基因组测序技术结合理化分析，对高温大曲和中温大曲的微生物群落与功能特征进行了系统比较，并深入解析了江农酱香白酒发酵过程中微生物群落的动态演替规律。该研究由曹连斌等人完成，为利用核心功能菌群及其功能特性提升白酒品质提供了重要理论参考。

研究人员采用的主要技术方法包括：从河南驻马店豫坡酒业有限公司采集高温大曲、中温大曲、堆发酵材料(stack fermentation material)和窖发酵粮(fermented grain)四类样本；通过重量法测定水分含量、干物质含量，采用标准方法测定酯化力(esterification power)、糖化力(saccharifying power)、液化力(liquefaction power)和蛋白酶活性(protease activity)；使用guan等人方法提取样本DNA，经Illumina平台(PE150)进行宏基因组测序；利用MEGA-HIT进行序列组装，通过MetaGeneMark预测开放阅读框(ORFs)，基于NR数据库进行物种注释，并利用KEGG、eggNOG和CAZy数据库进行功能注释。

微生物组成基于宏基因组学

研究发现在界水平上，高温大曲、中温大曲和堆发酵材料主要由细菌和真核生物组成，总相对丰度超过70%。高温大曲的细菌丰富度高于中温大曲，这可能是由于细菌更容易在高温环境下生长繁殖。在门水平上，中温大曲有3个门的平均相对丰度超过0.9%，分别为子囊菌门(Ascomycota)(52.81%)、杆菌门(Bacillota)(12.83%)和毛霉门(Mucoromycota)(2.30%)；而高温大曲有5个门的平均相对丰度超过0.9%，包括子囊菌门(29.10%)、放线菌门(Actinomycetota)(17.49%)、杆菌门(12.23%)、毛霉门(10.59%)和假单胞菌门(Pseudomonadota)(2.57%)。这些结果表明高温大曲比中温大曲具有更丰富的高丰度菌门，可能产生更多的风味物质。

微生物群落结构的差异

通过主坐标分析(PCA)、非度量多维标度(NMDS)和基于Bray-Curtis距离的聚类分析发现，四类样本组的物种组成结构明显可分。LEfSe分析显示，高温大曲和中温大曲之间以及堆发酵材料和窖发酵粮之间存在显著的微生物群落差异。高温大曲的显著差异物种包括横梗霉(Lichtheimia ramose)和直杆糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)，而中温大曲的显著差异物种包括宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)和埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)。

基于CAZy数据库的功能基因分类

主坐标分析显示，所有样本在CAZy level 2水平上呈现出不同的功能谱，主要包含6个CAZy类别：糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(GT)、碳水化合物结合模块(CBM)、辅助活性(AA)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)。其中GH酶在所有样本中占主导地位，这与它们在淀粉液化、糖化和纤维素降解中的关键作用一致。与中温大曲相比，高温大曲中GH23、GH25、GH28、GH34、GT2、GT4、GT35和GT51的相对丰度较高；而与高温大曲相比，中温大曲中GH18、GH31、GH3、GH43、GH47、GH78、GH92、GT31、GT1和AA3的相对丰度较高。这些基因功能的差异可能解释了为什么高温大曲和中温大曲会产生不同风味的白酒。

基于eggNOG数据库的功能基因分类

基因被聚类为24个eggNOG类别，其中七个主导功能为：S(未知功能)、L(复制/重组/修复)、E(氨基酸代谢/转运)、K(转录)、G(碳水化合物代谢/转运)、J(翻译/核糖体生物合成)和C(能量转换)。堆发酵材料中O(翻译后修饰)和U(细胞内运输)的丰度高于传统大曲，而窖发酵粮中P(无机离子运输)和M(细胞包膜生物合成)的丰度高于堆发酵材料，表明这些功能可能促进了发酵过程中芳香化合物的合成。

微生物群、宏基因组功能与理化性质之间的相关性

理化参数分析显示，中温大曲的糖化力(101.20±1.85 U/g)显著高于高温大曲(60.00±0.58 U/g)，而高温大曲的蛋白酶活性(62.47±5.84 U/mg)显著高于中温大曲(36.10±1.13 U/mg)。窖发酵粮的水分含量显著高于堆发酵材料，而干物质含量显著低于堆发酵材料。窖发酵粮的酯化力和蛋白酶活性(80.50±6.02 mg/g和22.71±6.87 U/mg)显著低于堆发酵材料(100.37±9.20 mg/g和32.23±1.80 U/mg)，而糖化力和液化力(106.8±1.07 mg/g和1.12±0.02 U/g)显著高于堆发酵材料(60±0.95 U/g和0.46±0.01 U/g)。这些结果表明，随着窖发酵粮中碳源的消耗，微生物倾向于提高糖化和液化能力以获得更多碳源，同时降低酯化力和蛋白酶活性以减少产物分泌。

该研究通过宏基因组学技术揭示了高温大曲和中温大曲在微生物群落结构和功能特征上的显著差异，并系统解析了江农酱香白酒发酵过程中微生物群落的动态演替规律。研究发现混合大曲继承了高温大曲和中温大曲的群落优势，发酵过程中显著差异物种从毕赤酵母属(Pichia sp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter sp.)和乳杆菌属(Lactobacillus sp.)转变为片球菌属(Pediococcus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、慢乳酸杆菌属(Lentilactobacillus sp.)、酵母属(Saccharomyces sp.)、热放线菌属(Thermoactinomyces sp.)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora sp.)，表明耐酸和耐乙醇微生物对风味物质生产的重