基于免疫信息学的肺炎支原体多表位候选疫苗设计与验证

《BMC Microbiology》：An immunoinformatics-based designed multi-epitope candidate vaccine against Mycoplasma pneumoniae

本研究针对肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）缺乏有效疫苗的临床难题，采用免疫信息学方法设计了一种新型多表位疫苗。研究人员通过表位筛选、分子对接、动态模拟等技术，证实该疫苗与TLR4受体具有高亲和力（结合能-21.7 kcal/mol），并能激发强烈的Th1免疫反应。该研究为开发安全有效的肺炎支原体疫苗提供了理论依据。

　　

社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia, CAP）一直是全球公共卫生的重要挑战，尤其对五岁以下儿童和伴有基础疾病的老年人影响显著。虽然肺炎链球菌疫苗的成功推广显著降低了由该病原体引起的CAP病例，但由肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）等非典型病原体引起的感染近年来却呈现上升趋势。更令人担忧的是，美国疾病控制与预防中心（CDC）的监测数据显示，在COVID-19大流行后，肺炎支原体感染，特别是在儿童和青少年中，出现了重新抬头的迹象。

肺炎支原体作为一种缺乏细胞壁的细菌，不仅难以通过传统培养方法检测，而且对靶向细胞壁合成的抗生素（如β-内酰胺类）天然耐药。此外，大环内酯类（macrolide）耐药菌株的出现，使得治疗选择更加有限。这种病原体通常每3-5年发生一次周期性暴发，虽然多数感染症状较轻，但也可能引发严重甚至暴发性肺炎，凸显了通过疫苗接种进行预防的迫切性。

然而，肺炎支原体疫苗的研发之路充满挑战。早期的全细胞或灭活疫苗尝试效果有限，并常在动物模型中引起不良炎症反应。病原体的抗原变异性及免疫逃逸能力进一步阻碍了传统疫苗策略的成功。因此，领域内亟需更安全、更有效的替代方案，例如多表位亚单位疫苗，它能够实现精准的免疫靶向，同时最大限度地降低脱靶效应的风险。

在此背景下，Shahbazi等人发表在《BMC Microbiology》上的研究，旨在利用免疫信息学这一强大工具，设计一种针对肺炎支原体的理性多表位疫苗候选物，以应对上述挑战。

为了开展这项研究，作者们采用了一系列关键的生物信息学和计算生物学技术。首先，从NCBI数据库获取肺炎支原体M129-B7菌株的基因组数据（RefSeq: GCF_900660465.1），作为筛选抗原的基础。研究团队运用了ORF Finder、PSORTb、SignalP等工具进行潜在抗原的鉴定、亚细胞定位和信号肽预测。随后，通过AlgPred、VaxiJen、ToxinPred2等服务器对候选抗原的表位进行抗原性、过敏原性和毒性评估。B细胞和T细胞（MHC-I和MHC-II）表位的预测则依赖于IEDB分析资源。在构建疫苗时，选用了霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit）作为佐剂，并采用EAAAK、PAPAP、KK、AAY、GGGGS等多种连接子（linker）连接各功能模块。疫苗的三级结构通过Robetta服务器预测，并利用GalaxyWEB进行优化。模型质量通过PROCHECK、ERRAT、ProSA和MolProbity进行评估。疫苗与免疫受体（TLR2和TLR4）的相互作用通过ClusPro和HADDOCK进行分子对接分析，结合能通过PRODIGY和MM/GBSA方法计算。此外，还进行了150纳秒的分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟以评估复合物稳定性，并使用C-ImmSim服务器进行免疫模拟预测免疫反应。最后，通过JCat工具进行密码子优化，并利用SnapGene进行pET-28a(+)载体的体外克隆模拟。

潜在抗原鉴定和表位预测

研究首先从肺炎支原体基因组中预测出7个潜在抗原。经过抗原性、过敏原性、毒性和亚细胞定位的综合筛选，蛋白5（Pr-5）因其最高的抗原性评分（0.8555）、非过敏原性、非毒性且位于细胞外的特性，被选为后续表位预测的最佳抗原。

B细胞和T细胞表位筛选

对Pr-5蛋白进行表位预测后，筛选出2个线性B细胞表位和7个同时与MHC-I和MHC-II分子结合的共有T细胞表位。这些表位均显示出良好的抗原性、非过敏原性和非毒性。其中抗原性最高的B细胞表位（SQNNEEVQTTYPVKSDQKATAK）和7个共有T细胞表位被用于疫苗构建。

疫苗构建与理化性质

最终的多表位疫苗构建体包含霍乱毒素B亚基佐剂、1个B细胞表位和7个T细胞表位，通过特定的连接子串联而成。该构建体由248个氨基酸组成，分子量为27,323.41 Da，理论等电点（pI）为8.90。不稳定指数（II）为35.49，表明蛋白质在体外可能稳定。总平均亲水性（GRAVY）为-0.777，提示其为亲水性蛋白。

疫苗结构预测与验证

二级结构预测显示疫苗构建体包含丰富的螺旋和卷曲结构。

三级结构模型通过Robetta服务器生成，并经过精修。质量验证显示，ProSA Z得分为-5.71，处于天然蛋白质结构的典型范围内；ERRAT整体质量因子为84.188%；Ramachandran图分析表明98.7%的残基位于最允许和额外允许区域，表明模型具有高立体化学质量。

分子对接与相互作用分析

分子对接结果表明，疫苗构建体与TLR4和TLR2均能有效结合。与TLR4的结合更为强烈，其最低能量簇的加权得分为-1467.1，并形成37个氢键；而与TLR2的对应值为-860.5，形成2个氢键。PRODIGY分析进一步证实了疫苗与TLR4的更强结合亲和力，其结合自由能（ΔG）为-21.7 kcal/mol，解离常数（K_d）为1.3×10^-16M，远优于与TLR2的结合（ΔG = -12.3 kcal/mol, K_d= 9.4×10^-10M）。PDBsum相互作用分析详细揭示了疫苗与受体间的氢键和疏水相互作用模式。

分子动力学模拟

为期150纳秒的MD模拟评估了疫苗、TLR2、TLR4以及它们复合物的结构稳定性。疫苗-TLR4复合物表现出最佳的稳定性，其骨架RMSD（Root Mean Square Deviation）平均值较低（0.44 nm），并在约20纳秒后达到稳定。半径（Rg）和残基涨落（RMSF）分析也表明疫苗-TLR4复合物结构紧凑，残基波动较小，进一步支持了其结合的稳定性。

结合自由能计算

MM/GBSA方法计算的结合自由能显示，疫苗与TLR4的结合（总能量-159.42 KJ/mol）比与TLR2的结合（总能量-56.15 KJ/mol）在热力学上更有利，这主要归因于更强的范德华力和静电相互作用。

免疫模拟

C-ImmSim服务器的免疫模拟预测了三次注射后宿主的免疫反应。结果显示，抗原清除后，免疫球蛋白（IgM、IgG1、IgG2）水平显著升高，B细胞和辅助T细胞（T_H）群体，包括记忆细胞，均出现强劲的二次反应。尤为重要的是，细胞因子谱显示干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）等与Th1型免疫反应相关的细胞因子水平显著提升，同时伴有调节性细胞因子（如IL-10）的适度增加，表明疫苗可能诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，这对于对抗胞内病原体至关重要。

密码子优化与体外克隆

密码子优化后，疫苗序列的密码子适应指数（CAI）从0.58提升至1.0，GC含量从51.07%调整至48.65%，使其更适合在大肠杆菌K12菌株中表达。体外克隆模拟成功将优化后的基因序列（约750 bp）克隆到pET-28a(+)表达载体中，并通过双酶切（NcoI和XhoI）验证。

群体覆盖率分析

基于所选T细胞表位与HLA等位基因的结合预测，群体覆盖率分析表明，该疫苗构建体预计可在全球范围内覆盖50.69%的人群，平均每个个体可识别1.53个表位-HLA组合，显示了其潜在的广泛适用性。

本研究通过系统的免疫信息学流程，成功设计了一种针对肺炎支原体的多表位疫苗候选物。该疫苗在计算机水平上展现出良好的特性：所选表位具有高抗原性、非过敏原性和非毒性；疫苗构建体结构稳定，并能与关键的天然免疫受体TLR4和TLR2，特别是TLR4，发生高亲和力、稳定的结合；分子动力学模拟证实了复合物的稳定性；免疫模拟预测其能诱导强烈的、偏向Th1型的体液和细胞免疫反应，且具有可观的全球人口覆盖率；密码子优化和体外克隆模拟表明其具备在大肠杆菌系统中进行重组表达的可能性。

该研究的讨论部分指出，与传统疫苗策略相比，这种免疫信息学指导的多表位疫苗设计具有精准、安全和高效的潜力。TLR4被确定为疫苗作用的一个关键受体，这与TLR4在识别细菌成分和协调抗肺炎支原体免疫应答中的已知作用相符。研究所预测的强Th1免疫反应（以高水平的IFN-γ为特征）对于有效防御肺炎支原体这类病原体至关重要。虽然本研究在计算层面进行了广泛验证，但其结果仍需通过体外和体内实验进一步证实，以评估其实际的免疫原性和保护效果。

总之，这项由Shahbazi等人完成的工作，为应对肺炎支原体感染这一持续的公共卫生挑战提供了一个有前景的疫苗候选设计方案。其综合性的计算机分析为后续的临床前研究奠定了坚实的基础，推动了新型肺炎支原体疫苗的开发进程。