石膏洞穴空气微生物组的比较研究：培养与非培养方法揭示环境分区与生态动力学

为解决传统培养方法在洞穴空气微生物研究中的偏差问题，研究人员采用高通量测序(NGS)与环境监测相结合的方法，对西班牙Sorbas石膏洞穴开展空气微生物组比较研究。结果揭示NGS检测到749个细菌属，远超培养方法的24个属，并发现微生物分布与洞穴通风模式、CO2/CH4浓度梯度显著相关。该研究为洞穴微生物生态起源、传播及环境保护提供了全新视角。

　　

在神秘的地下洞穴世界中，微生物不仅构成了生态系统的重要基础，更是探索生命极限和起源的天然实验室。然而，传统洞穴微生物研究长期依赖培养方法，导致绝大多数不可培养微生物被忽视，如同只看到冰山一角。尤其在全球洞穴旅游开发与保护矛盾日益突出的背景下，全面了解洞穴微生物的组成、来源和分布规律，已成为环境微生物学和保护科学的重要课题。西班牙Sorbas石膏岩溶区作为半干旱地区的典型代表，其洞穴系统具有独特的地质结构和微气候特征，是研究微生物与环境相互作用的理想场所。发表于《Microbial Ecology》的这项研究，首次将培养与非培养方法结合，深入揭示了石膏洞穴空气微生物组的真实面貌。

研究团队采用表面空气系统(SAS)进行可培养细菌分离，并通过16S rRNA基因测序鉴定；同时利用Coriolis μ空气采样器收集不可培养微生物，结合16S rRNA基因V3-V4区扩增与Illumina MiSeq测序进行高通量分析。环境监测包括温度、湿度、CO₂和CH₄浓度测量，采用CRDS分析仪测定同位素组成。样本来源于西班牙Sorbas石膏岩溶区的Covadura和C3洞穴，共采集18个空气样本（含外部对照），通过Qiime2和SILVA数据库进行生物信息学分析。

微生物多样性分析

NGS技术揭示了远超传统培养方法的微生物多样性：共检测到749个细菌属和12,861个ASVs（扩增子序列变体），而培养方法仅鉴定出24个属。Shannon多样性指数显示Covadura洞穴多样性最高（中位数7.37），C3洞穴较低（6.11），反映了洞穴大小和环境稳定性对微生物多样性的影响。NMDS分析表明洞穴内部与外部空气微生物群落结构显著分离，且Covadura洞穴内不同通风区形成独特聚类。

可培养与不可培养细菌的比较

培养方法主要回收厚壁菌门(Bacillota)和放线菌门(Actinomycetota)的革兰阳性孢子形成菌（如芽孢杆菌属(Bacillus)、微小杆菌属(Micrococcus)），这些在NGS数据中相对丰度较低或缺失。NGS则检测到大量革兰阴性菌和稀有细菌，如假单胞菌门(Pseudomonadota)（14.98-72.52%）和放线菌门（13.75-44.88%）为主导类群。两方法仅共享3个物种（微小球菌属(Micrococcus luteus)、 terreibacillus属和耐寒周芽孢杆菌(Peribacillus frigoritolerans)），凸显培养方法的严重偏差。

环境分区与微生物分布

通过CH₄和CO₂示踪剂分析，洞穴被划分为不同通风区：Covadura洞穴存在三个亚区（内部低通风区、中间过渡区和外部高通风区），C3洞穴整体通风较差。微生物分布与通风模式紧密相关：Massilia和链霉菌属(Streptomyces)在入口区丰度高并向内部递减；相反，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和芽生球菌属(Blastococcus)在深部富集。COV-4位点因有机质输入而成为微生物热点，富含不动杆菌属(Acinetobacter)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)（36.77%）。

微生物来源与生态意义

NGS数据显示洞穴空气微生物与生物膜、沉积物群落高度相似，表明内部来源（如生物膜脱落、沉积物再悬浮）的重要贡献。同时，外部干旱土壤菌群（如Rubrobacter、WD2101土壤组）通过空气交换输入洞穴。甲烷氧化类群（如甲基杆菌属(Methylobacterium-Methylorubrum)）在低CH₄区域富集，证实了微生物对洞穴气体循环的调控作用。

本研究

本研究通过整合高通量测序与环境监测，证实了石膏洞穴空气微生物组的复杂性和双重来源（内部生成与外部输入），其分布受通风模式和微气候条件严格调控。传统培养方法不仅严重低估多样性，还扭曲了微生物群落的真实生态结构，如过度代表孢子形成菌而忽略革兰阴性菌。从应用角度看，该研究为洞穴保护提供了科学依据：通风设计可调控微生物传播，减少人类活动对洞穴生态的干扰；同时揭示了干旱环境微生物的适应性特征，为特殊微生物资源的开发利用奠定基础。方法论上，研究证明了NGS技术在环境微生物学中的不可替代性，并呼吁未来研究结合长读长测序与功能基因分析，以更全面揭示洞穴微生物的生态功能与进化潜力。