基于重组酶聚合酶扩增和侧向色谱微流控芯片技术的食源性病原微生物快速检测方法

《iLABMED》：Rapid Detection of Foodborne Pathogenic Microorganisms Based on Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Chromatography Microfluidic Chip Technology

快速检测食源性病原体的微流控芯片设计及优化。通过集成重组酶聚合酶扩增（RPA）与胶体金侧流层析技术，构建了可在30分钟内实现E. coli O157:H7、V. parahaemolyticus和V. cholerae的快速可视化检测系统，灵敏度达102 CFU/mL，无需热循环仪。研究优化了RPA反应条件（40°C/20分钟）和侧流层析标记体系，验证了芯片的高特异性与稳定性，适用于资源有限地区的现场检测。

　　在当今社会，食品安全已成为全球关注的焦点之一。随着食品供应链的日益复杂，食品中可能存在的病原体威胁也愈发严重。这些病原体不仅可能导致严重的健康问题，还可能对整个食品产业造成巨大经济损失。因此，开发一种快速、准确且便于现场使用的检测技术显得尤为重要。本研究聚焦于一种创新的检测方法，旨在通过结合重组酶等温扩增（RPA）技术与胶体金侧向层析技术，构建出一种微型流体芯片，用于快速识别三种高风险的食源性病原体：大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌（VP）和霍乱弧菌（VC）。这种方法的出现，为现场检测提供了一种高效、低成本且易于操作的解决方案。

传统的食源性病原体检测方法通常依赖于实验室环境，不仅需要复杂的设备和专业人员，还存在检测周期长、成本高等问题。这使得它们在资源有限的地区难以广泛应用。尽管近年来快速定量PCR技术有所进步，但其对热循环仪的依赖以及较高的设备成本仍然是推广的障碍。因此，研究者们开始探索替代方案，其中等温扩增技术因其无需热循环、反应速度快、操作简便等优势，成为研究热点。RPA作为一种等温扩增技术，能够在恒定温度下快速扩增目标DNA，大大降低了检测成本和复杂性。

为了进一步提高检测的便捷性和适用性，研究团队设计了一种集成RPA与胶体金侧向层析技术的微型流体芯片。这种芯片采用激光蚀刻技术制造，具备三个主要层：底层、反应腔层和盖层。其中，反应腔层包含一个可移动的插入部件，用于引导液体流动。这种设计避免了传统检测方法中对复杂机械装置的依赖，使得整个检测过程更加简单且自动化。同时，通过优化RPA反应条件，包括引物浓度、反应温度和反应时间，研究团队成功实现了对三种病原体的高灵敏度和高特异性检测。

在引物设计方面，研究团队选择了针对大肠杆菌O157:H7的rfbE基因、针对副溶血性弧菌的toxR基因以及针对霍乱弧菌的ctxA基因作为目标。这些基因在各自的病原体中具有高度保守性，能够有效区分目标病原体与其他非目标微生物。通过使用Primer 5.0软件手动设计引物，并结合DNAMAN软件进行结构分析，确保了引物的特异性。在实际应用中，引物的浓度对检测结果具有重要影响。研究团队通过调整引物浓度，发现0.40 μmol/L为最佳选择，既能保证检测信号的强度，又能避免非特异性反应导致的假阳性。

反应温度的优化也是检测系统性能的关键因素之一。研究团队测试了36°C、38°C、40°C和42°C四种温度条件，发现40°C是最佳反应温度。这不仅确保了RPA反应的效率，还保持了检测结果的稳定性和可重复性。此外，反应时间的优化同样至关重要。通过测试不同反应时间下的检测效果，研究团队最终确定20分钟为最佳反应时间，既能保证充分的扩增，又能够有效减少非特异性产物的生成，从而提高检测的准确性。

为了验证该检测方法的特异性，研究团队使用了五种不同的病原体，包括大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌（SE）和金黄色葡萄球菌（SA）。通过将这些病原体的基因组DNA加入到芯片中，检测结果显示，只有目标病原体的DNA在检测线上显示出明显的红色条带，而其他非目标微生物则未出现任何反应。这一结果表明，该检测方法具有良好的特异性，能够有效避免交叉反应，提高检测的可靠性。

检测灵敏度方面，该芯片能够检测到每毫升102个菌落形成单位（CFU/mL）的病原体，这一灵敏度水平在实际应用中具有重要意义。这意味着即使在低浓度情况下，该芯片也能提供准确的检测结果，适用于多种食品样本的检测需求。此外，研究团队还进行了重复性测试，使用三种病原体的高浓度和低浓度样本进行三次重复检测，结果一致，表明该检测系统具有良好的重复性和稳定性。

该微型流体芯片的另一个显著优势是其便携性和低成本。与传统需要昂贵热循环仪和信号读取设备的检测方法相比，该芯片无需这些复杂设备即可完成检测，这使得其在资源有限的地区具有更高的适用性。同时，芯片的设计使其能够一次性使用，减少了交叉污染的风险，提高了检测的效率和安全性。

此外，该检测方法的可视化特性也是其一大亮点。通过胶体金侧向层析技术，检测结果能够在10分钟内以肉眼可见的方式呈现，无需额外的仪器设备进行分析。这一特点使得检测过程更加直观，便于现场操作人员快速判断结果，提高了检测的实用性和普及性。

在实际应用中，该芯片能够有效应对多种食品样本的检测需求。无论是液体样本还是固体样本，都可以通过简单的预处理步骤，将样本引入到芯片的反应腔中，并通过恒温反应完成扩增。随后，扩增产物通过芯片的流动系统被引导至侧向层析检测区，最终在检测带上显示出结果。这种流程不仅减少了操作步骤，还提高了检测的效率和准确性。

研究团队在实验过程中还考虑了检测方法的长期稳定性。通过将芯片在50°C环境下保存3天后进行检测，结果仍然保持良好的灵敏度和特异性，表明该芯片具有较长的使用寿命和可靠的检测性能。这一特性对于需要长期储存和运输的检测设备尤为重要，确保了其在不同环境下的适用性。

总的来说，这项研究提出了一种集成RPA与胶体金侧向层析技术的微型流体芯片，能够快速、准确地检测三种高风险的食源性病原体。该芯片的设计和优化不仅提高了检测的效率，还降低了成本，使其在资源有限的环境中具有更高的适用性。同时，其良好的特异性、重复性和稳定性，进一步增强了其在实际应用中的可靠性。这一创新方法为食品安全检测提供了一种新的思路，有望在未来的食品安全监测中发挥重要作用。