DAI触发结直肠癌细胞铁死亡通过激活cGAS-STING通路重编程肿瘤相关巨噬细胞平衡促进抗肿瘤免疫

本研究发现DNA依赖性干扰素调节因子激活剂（DAI）可诱导结直肠癌（CRC）细胞发生铁死亡（ferroptosis），通过线粒体氧化应激导致线粒体DNA（mtDNA）释放至胞质，激活cGAS-STING信号通路，进而重编程肿瘤免疫微环境（TIME），促进肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向M1型极化并抑制M2型极化，显著抑制肿瘤生长。该研究为基于程序性细胞死亡（PCD）的肿瘤免疫治疗策略提供了新靶点。

　　

引言

结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，免疫治疗已成为限制其恶性进展的有效策略。然而，对于微卫星稳定（MSS）状态的患者，免疫治疗效果有限。肿瘤免疫微环境（TIME）在肿瘤免疫监视中起着重要作用，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）通过M1/M2表型平衡调节肿瘤免疫。M2型TAMs促进肿瘤进展，而M1型则具有促炎和杀伤肿瘤作用。铁死亡是一种以脂质过氧化（LPO）为特征的促炎性程序性细胞死亡（PCD）形式，是抗肿瘤免疫治疗的关键药物靶点。铁死亡过程中活性氧（ROS）诱导线粒体基质脂质过氧化，导致线粒体功能障碍和线粒体DNA（mtDNA）释放至胞质。研究表明，内源性mtDNA特异性激活cGAS-STING通路可刺激多种促炎细胞因子分泌，改变TIME并诱导有效的抗肿瘤免疫应答。DNA依赖性干扰素调节因子激活剂（DAI），也称为Z-DNA结合蛋白1（ZBP1），已知可触发多种PCD，尤其是坏死性凋亡。值得注意的是，大多数肿瘤缺乏DAI表达，表明DAI在肿瘤发生和发展中具有重要作用。最近的研究发现，DAI可通过招募和磷酸化RIPK3引发内皮细胞铁死亡。然而，DAI是否能诱导肿瘤细胞铁死亡并通过激活cGAS-STING通路重编程TIME尚待研究。

材料与方法

使用BALB/c裸鼠（雌性，6-8周）和CT-26细胞系（小鼠CRC细胞）以及Raw 264.7细胞系（小鼠单核-巨噬细胞白血病细胞）。CT-26细胞分为四组：野生型（WT）组、阴性对照（NC）组（转导空质粒）、DAI过表达（OE）组（转导DAI-OE质粒）和DAI-OE+ferrostatin-1（Fer-1）组。通过Western blot和RT-qPCR检测DAI过表达效果。使用CCK-8检测细胞活力，LDH测定试剂盒评估细胞死亡。使用相应试剂盒检测细胞内Fe²⁺、ROS和LPO水平。通过MMP测定试剂盒检测线粒体膜电位变化，透射电镜观察线粒体病理变化。使用mtDNA提取试剂盒分离mtDNA和胞质mtDNA，RT-qPCR进行定量。通过流式细胞术分析表面标志物，ELISA检测细胞因子和趋化因子水平。建立小鼠肿瘤模型，皮下接种CT-26细胞，并使用cGAS抑制剂RU.521处理。

结果

DAI激活可诱导小鼠CRC细胞铁死亡

研究发现，在CT-26细胞中DAI基础表达水平较低。DAI过表达后，观察到RIPK3和MLKL的明显磷酸化。DAI-OE组细胞活力显著抑制，LDH水平显著上调。DAI-OE组细胞内ROS、LPO和Fe²⁺水平显著增加，抗氧化蛋白GPX4和SLC7A11水平显著降低。添加铁死亡抑制剂Fer-1可逆转这些效应，表明DAI可触发肿瘤细胞铁死亡。

DAI触发铁死亡诱导线粒体功能障碍和mtDNA释放

DAI-OE细胞出现明显的线粒体碎片化和嵴消失，线粒体膜电位显著降低。DAI-OE组mtDNA水平显著降低，胞质mtDNA含量增加，Fer-1预处理可减轻这一现象，表明DAI触发铁死亡诱导线粒体损伤和mtDNA释放。

DAI触发铁死亡诱导mtDNA释放激活cGAS-STING通路

DAI-OE细胞STING和TBK1磷酸化水平显著增加，IFN-β表达上调，Fer-1处理可明显下调这些效应，证实DAI触发铁死亡通过诱导线粒体应激和mtDNA释放激活小鼠CRC细胞中的cGAS-STING通路。

DAI触发肿瘤细胞死亡通过影响巨噬细胞极化重编程TIME

NC组上清显著促进M2极化，而DAI-OE组上清显著抑制M2极化并增加M1巨噬细胞比例。DAI-OE细胞IFN-γ水平显著上调，IL-4和IL-10水平明显下调。DAI-OE组上清还部分抵消了IL-4的M2极化诱导作用。这些结果表明DAI触发肿瘤细胞死亡可能通过激活cGAS-STING通路重编程巨噬细胞M1/M2比率。

DAI触发铁死亡激活cGAS-STING通路介导的抗肿瘤免疫

DAI-OE处理显著抑制肿瘤生长，而RU.521处理部分阻断DAI-OE的抗肿瘤效果。DAI-OE肿瘤组织中STING和TBK1磷酸化水平显著增加，IFN-β、IFN-γ、TNF-α和CXCL10水平显著升高。DAI-OE组肿瘤组织中CD8⁺ T细胞浸润显著增加，RU.521处理可部分逆转这一现象。血清生化参数无显著差异，表明DAI触发铁死亡通过激活cGAS-STING通路引发抗肿瘤免疫应答并重编程TIME，具有良好的生物安全性。

DAI触发铁死亡通过激活cGAS-STING通路重编程体内TAMs平衡

对照组M2/M1巨噬细胞比率较高，DAI-OE显著上调M1型巨噬细胞比例，并明显抑制M2极化。RU.521处理部分逆转这一现象。ELISA结果与流式细胞术结果一致，表明DAI触发铁死亡通过激活cGAS-STING通路重编程TIME中的TAMs平衡，从而在体内引发强大的抗肿瘤免疫应答。

讨论

本研究首次发现DAI在触发肿瘤细胞铁死亡中的关键作用。DAI触发的小鼠CRC细胞铁死亡导致线粒体氧化应激和后续mtDNA释放，最终激活cGAS-STING通路介导的抗肿瘤免疫应答。研究进一步证实DAI触发铁死亡可通过激活cGAS-STING通路重编程TAMs平衡，从而显著抑制体内肿瘤生长。先前研究已建立PCD与肿瘤发生和发展的相关性，几种PCD通路已被认为是抗肿瘤化疗和免疫治疗的关键药物靶点。DAI是多种PCD模式的触发器，包括凋亡、坏死性凋亡和焦亡（统称为PANoptosis），其中DAI依赖性坏死性凋亡与抗肿瘤化疗密切相关。关于DAI触发肿瘤细胞铁死亡的具体机制，研究表明DAI-RIPK3轴通过磷酸化抑制铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的酶活性，从而促进内皮细胞铁死亡。另一项研究发现，DAI通过促进ROS的产生促进急性肝损伤期间的肝细胞死亡，ROS是铁死亡的关键触发因素。因此，DAI驱动铁死亡在肿瘤细胞中的准确调控机制仍有争议，需要在未来的研究中进一步调查。线粒体作为肿瘤生长能量供应的重要参与者，靶向破坏肿瘤细胞中的线粒体可能对抗肿瘤治疗具有重要意义。DAI触发铁死亡对线粒体的靶向破坏作用表现为MMP显著降低和结构破坏，以及mtDNA释放到细胞质中。类似地，最近的两项研究报告了铁死亡相关线粒体氧化应激和mtDNA释放在介导有效抗肿瘤免疫应答中的关键作用。因此，数据表明铁死亡和线粒体氧化应激都有助于DAI介导的肿瘤细胞死亡。cGAS识别dsDNA后催化合成第二信使cGAMP，激活下游STING信号，引发抗原呈递细胞（APCs）介导的抗肿瘤免疫应答。最近的研究报告了各种新策略，能够通过内源性dsDNA（如mtDNA）特异性激活cGAS-STING通路，诱导强大的抗肿瘤免疫应答。在本研究中，证实这种激活现象也适用于DAI触发铁死亡期间释放的mtDNA与cGAS的相互作用。STING和TBK1的磷酸化以及cGAS-STING通路产物IFN-β在DAI-OE组细胞中显著上调，添加铁死亡抑制剂Fer-1可部分减弱这些效应，表明DAI触发铁死亡在激活cGAS-STING通路中不可或缺。值得注意的是，在本研究中，单独药理学抑制铁死亡并不能完全挽救细胞死亡和cGAS激活。这可能是因为除了诱导铁死亡，DAI还可能触发其他PCD通路，如坏死性凋亡，并通过核DNA激活cGAS-STING通路。通过Western blot分析在体外和体内实验中确实观察到MLKL的伴随磷酸化，MLKL是DAI介导的坏死性凋亡的关键执行分子。此外，最近的研究表明cGAS-STING通路参与激活NF-κB炎症信号，这将进一步增强DAI驱动的抗肿瘤免疫应答。因此，研究发现为通过内源性dsDNA感知触发cGAS-STING通路介导的抗肿瘤免疫应答提供了另一个潜在靶点。更重要的是，研究深入探讨了DAI触发铁死亡对TIME的影响。通常认为免疫抑制性TIME负责肿瘤免疫逃避和免疫治疗效果降低。TIME内的多种免疫细胞共同调节肿瘤免疫状态，其中TAMs的M1/M2亚群平衡起着重要作用。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞向TIME分泌抗炎细胞因子，促使TAMs向免疫抑制性M2表型极化，从而操纵TIME，有利于其生长和转移。在本工作中，DAI触发铁死亡激活cGAS-STING通路，增强促炎细胞因子（IFN-β、IFN-γ和TNF-α）和趋化因子（CXCL10）的表达，同时增加CD8⁺ T细胞的浸润。鉴于报道的IFN-β、IFN-γ和TNF-α对巨噬细胞的M1型诱导作用，确定了DAI触发铁死亡是否可以促进TAMs M1极化。发现DAI触发铁死亡显著诱导TAMs M1极化，同时阻止TAMs向M2型极化。在小鼠肿瘤模型中，进一步证实DAI触发铁死亡通过激活cGAS-STING通路调节TAMs极化，并显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，与体外DAI OE触发的细胞死亡和cGAS激活类似，添加cGAS抑制剂仅部分抑制抗肿瘤效果，这可能归因于细胞因子之间潜在的正反馈效应以及TIME中复杂多样的PCD信号网络。

研究局限性

尽管研究首次确定了DAI在肿瘤细胞中触发的一种新型PCD形式，但DAI在肿瘤细胞中触发的其他PCD形式及其作用以及与铁死亡在介导抗肿瘤免疫中的交叉对话仍未知。mtDNA或核DNA激活cGAS-STING通路的具体机制以及cGAS-STING通路调节细胞因子分泌和重编程TAMs平衡的分子机制尚不清楚。此外，DAI触发铁死亡诱导的mtDNA介导的cGAS-STING激活对TIME内其他免疫细胞（如树突状细胞）的具体调节作用尚未完全阐明。考虑到临床转化的潜力，这些抗肿瘤机制在不同免疫背景的肿瘤和其他类型肿瘤模型中的可行性仍需在未来研究中进一步验证。

总结

本研究鉴定并初步阐明了DAI在CRC细胞中触发的铁死亡诱导cGAS-STING介导的抗肿瘤通路。尽管仍有一些问题需要进一步研究，但这些发现为PCD在抗肿瘤免疫治疗中的作用提供了新的见解，并为CRC治疗筛选出潜在靶点。