Eb4Mab-7-mG2a的设计与评估：一种用于乳腺癌靶向治疗的双功能抗EphB4单克隆抗体

本研究报告了一种新型抗EphB4单克隆抗体Eb4Mab-7-mG2a，通过亚类转换为IgG2a增强其抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）效应功能。研究证实该抗体能有效阻断Ephrin-B2诱导的ERK磷酸化与细胞增殖，并选择性杀伤EphB4阳性肿瘤细胞。体内实验显示其显著抑制异种移植瘤生长，表明其通过配体阻断与免疫效应器激活的双重机制发挥抗肿瘤活性，为EphB4阳性乳腺癌的精准治疗提供了新策略。

　　

摘要

乳腺癌仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，亟需新型有效的治疗策略。Eph受体酪氨酸激酶，尤其是EphB4，在癌症生物学中扮演着复杂角色，其功能取决于细胞环境与配体结合情况。EphB4在乳腺癌中频繁过表达，并通过与其配体Ephrin-B2的异常相互作用导致信号失调与肿瘤进展。本研究开发了一种改进的抗EphB4单克隆抗体Eb₄Mab-7-mG_2a，该抗体为亚类转换的IgG_2a变体，旨在增强免疫效应功能，特别是抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性 cytotoxicity（CDC）。研究结果显示，Eb₄Mab-7-mG_2a能有效阻断Ephrin-B2诱导的ERK磷酸化与EphB4阳性MCF-7乳腺癌细胞的增殖，但对EphB4敲除（KO）的MCF-7细胞无影响。流式细胞术证实了Eb₄Mab-7-mG_2a与EphB4表达细胞的高亲和力结合，而体外实验证明了其对EphB4阳性肿瘤细胞的有效且选择性的ADCC与CDC活性。体内实验表明，Eb₄Mab-7-mG_2a显著抑制了EphB4过表达CHO-K1与EphB4阳性MCF-7异种移植瘤的生长，但在EphB4阴性CHO-K1与EphB4-KO MCF-7异种移植瘤中未显示治疗效果。免疫组化分析显示，经治疗的肿瘤中Ki-67增殖指数降低，支持了所开发抗体的抗增殖效应。总之，这些发现表明Eb₄Mab-7-mG_2a通过配体阻断与免疫效应器参与发挥双重抗肿瘤活性。有必要在其他EphB4过表达癌症中以及与免疫检查点抑制剂联用进行进一步评估。人源化与肿瘤选择性工程化可能增强其在精准肿瘤学中的临床潜力。

缩略语

ADCC：抗体依赖性细胞毒性；CAR：嵌合抗原受体；CasMab：癌症特异性单克隆抗体；CDC：补体依赖性细胞毒性；EphB4：促红细胞生成素产生性肝细胞癌受体B4；ERK：细胞外信号调节激酶；FBS：胎牛血清；KO：敲除；mAb：单克隆抗体；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PDPN：平足蛋白；SDS–PAGE：十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳；TME：肿瘤微环境。

1 引言

乳腺癌仍是全球女性中最常见且致命的恶性肿瘤之一，2020年占所有癌症病例的11.7%与癌症相关死亡的6.9%。尽管在早期检测与系统治疗方面有所改进，乳腺癌仍是女性癌症相关死亡的第二大原因，凸显了对新颖且更有效治疗策略的迫切需求。

Eph受体酪氨酸激酶根据其配体结合特异性可分为EphA和EphB亚类，是最大的受体酪氨酸激酶家族。EphB受体，包括EphB4，通过与跨膜Ephrin-B配体相互作用启动下游信号传导。在EphB受体中，EphB4因其在癌症生物学中的环境依赖性角色而受到显著关注，具体表现为其根据细胞环境与配体可用性可作为肿瘤促进因子或抑制因子。

EphB4在乳腺癌中频繁过表达，并通过与其通常失调的配体Ephrin-B2的相互作用引起异常的下游信号传导。这种异常信号传导不仅促进肿瘤增殖，还在某些肿瘤环境中促进血管生成与血管重塑。这种失调可能不仅归因于改变的配体可用性，还归因于受体定位或聚集的变化，共同通过自分泌或旁分泌机制增强配体依赖性信号传导。值得注意的是，Xiao等人证明，在MCF-7乳腺癌细胞中用Ephrin-B2或激动性单克隆抗体刺激EphB4会激活RAS/MEK/ERK信号级联，触发增强的细胞增殖。相反，在内皮细胞中相同的EphB4激活会抑制ERK活性并抑制增殖，说明了EphB4显著的环境依赖性功能。这些机制性见解突出了EphB4的生物学复杂性及其作为环境特异性治疗靶点的重要性。总之，这些发现表明，即使在部分配体失调的情况下，异常的配体介导的EphB4信号传导也可能通过ERK通路激活驱动恶性表型。尽管其具有环境依赖性的双重功能，EphB4在此背景下可作为潜在的致癌驱动因子。

鉴于配体诱导的EphB4信号传导在乳腺癌细胞中的致癌潜力，阻断该通路代表了一种有前景的治疗方法。在我们先前的工作中，我们开发了一种靶向EphB4的单克隆抗体B4Mab-7（也称为Eb₄Mab-7，IgG₁ kappa）。在本研究中，我们设计了一个改进版本Eb₄Mab-7-mG_2a，这是一个亚类转换的IgG_2a变体，旨在增强免疫效应功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。该抗体通过同时阻断Ephrin-B2诱导的ERK信号传导和激活免疫效应机制展现双重功能。尽管几种治疗性抗体通过信号调制或免疫介导的细胞毒性发挥作用，但研究表明在单一抗体中结合两种机制可以增强抗肿瘤疗效。

因此，本研究旨在通过表征其作用机制并证明其体外和体内抗肿瘤疗效，评估Eb₄Mab-7-mG_2a作为EphB4阳性乳腺癌新型双功能治疗候选物的效用。

2 材料与方法

2.1 Kaplan-Meier生存分析

使用KMplot在线工具对EPHB基因家族所有成员进行Kaplan-Meier生存分析，应用来自乳腺癌样本的RNA-seq基于表达数据。选择总生存期（OS）作为终点，随访阈值设为120个月，并对此时间点后的数据进行审查。使用自动选择的截断值将患者分为高表达和低表达组，该截断值在四分位范围内以最佳分离生存结果。所有其他临床和免疫相关协变量均不受限制。摘要结果包括样本量（n）、截断值、表达范围、对数秩P值、错误发现率（FDR）和风险比（HR），呈现在表S1中，HR和对数秩P值也在图1A中显示。

2.2 细胞系与细胞培养

中国仓鼠卵巢（CHO）-K1、MCF-7、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-468和MCF10A细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。HBC5细胞系由JCRB细胞库（日本大阪）提供。EphB4过表达CHO-K1（CHO/EphB4）和EphB4敲除（KO）MCF-7（也称为BINDS-52）细胞系在我们先前的研究中创建。CHO-K1、HBC5和CHO/EphB4细胞在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640培养基（日本京都Nacalai Tesque Inc.）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（FBS；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher Scientific Inc.）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和0.25 μg/mL两性霉素B（Nacalai Tesque Inc.）。MCF-7、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-468和EphB4-KO MCF-7细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Nacalai Tesque Inc.）中培养，补充10%热灭活FBS和相同抗生素。MCF10A细胞在乳腺上皮细胞生长培养基（美国马里兰州沃克斯维尔Lonza）中维持，并根据制造商说明添加生长补充剂。所有细胞在37°C、含5% CO?的湿润气氛中孵育。

2.3 重组抗体生产

抗EphB4单克隆抗体B4Mab-7（IgG₁）如先前所述开发。为生产小鼠IgG₁和IgG_2a亚类的重组抗体，从产生B4Mab-7的杂交瘤中分离V_H和V_L cDNA。V_H cDNA与小鼠IgG₁或IgG_2a的C_H组合并插入pCAG-Ble载体（日本大阪FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）。类似地，V_L cDNA和小鼠kappa轻链插入pCAG-Neo载体（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）。这些载体然后使用ExpiCHO表达系统（Thermo Fisher Scientific Inc.）转染到ExpiCHO或BINDS-09细胞（Fut8-KO ExpiCHO-S细胞）中，之后收获培养上清液。使用Ab-Capcher（日本香川县ProteNova Co. Ltd.）纯化B4Mab-7和Eb₄Mab-7-mG_2a抗体。

2.4 Western印迹分析

Western印迹分析如先前所述进行。细胞使用含20 mmol/L HEPES（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、1%（v/v）Triton X-100、10%（v/v）甘油、1 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaF、50 mmol/L β-甘油磷酸酯、1 mmol/L原钒酸钠（Na?VO?）和25 μg/mL抑肽酶、亮肽素和胃蛋白酶素的缓冲液裂解。对于ERK磷酸化分析，将MCF-7和EphB4-KO MCF-7细胞血清饥饿12小时，然后在含1%透析FBS的培养基中用5 μg/mL重组人Ephrin-B2（美国明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）刺激0、5、10、15、30或60分钟。细胞与5 μg/mL Eb₄Mab-7-mG_2a或对照PMab-231共处理指定时间于37°C。PMab-231是一种识别虎平足蛋白（PDPN）的小鼠IgG_2a单克隆抗体，不与人类细胞交叉反应，并如先前报道用作对照抗体。蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并用后面列出的初级抗体进行免疫印迹。除细胞裂解液外，使用市售正常人乳腺组织裂解液（总蛋白–人成人正常组织：乳腺，美国科罗拉多州利特尔顿Novus Biologicals）评估正常乳腺组织中的表达。使用适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联二级抗体（美国马萨诸塞州丹弗斯Cell Signaling Technology Inc.）检测抗体结合，随后进行ECL检测（ECL Prime；日本东京Cytiva）。使用的初级抗体如下：抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204；#4370，Cell Signaling Technology Inc.）、抗总ERK1/2（克隆C-9；sc-514302，美国德克萨斯州达拉斯Santa Cruz Biotechnology）、抗EphB4（Eb₄Mab-7-mG_2a）、抗β-肌动蛋白（D6A8）兔单抗（HRP偶联物；#12620，Cell Signaling Technology Inc.）和抗GAPDH（D16H11）XP兔单抗（#5174，Cell Signaling Technology Inc.）。使用ImageJ软件量化条带强度。

2.5 体外增殖试验

使用MTS四唑鎓 assay（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay；美国威斯康星州麦迪逊Promega）评估细胞增殖。将细胞以每孔2000个细胞接种到96孔板中，每孔100 μL含测试剂（如抗体或重组Ephrin-B2）的培养基。在指定时间点（通常0至3天），直接将20 μL MTS试剂添加到每孔（最终体积120 μL）并在37°C孵育30分钟。使用PowerScan HT微孔板读数仪（美国佛蒙特州威努斯基BioTek Instruments）在490 nm处测量吸光度，参考波长为630 nm。每个条件分析三个复孔，结果表示为平均值±标准差（SD）。使用Mann-Whitney U检验确定统计显著性。p < 0.05；*p < 0.01；n.s.，不显著。

2.6 流式细胞术

使用1 mM乙二胺四乙酸（EDTA；Nacalai Tesque Inc.）结合0.25%胰蛋白酶收获CHO-K1、CHO/EphB4、MCF-7和EphB4-KO MCF-7细胞系。细胞与B4Mab-7、Eb₄Mab-7-mG_2a或对照封闭缓冲液（0.1%牛血清 albumin（BSA）溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS））在4°C孵育30分钟，随后与Alexa Fluor 488偶联抗小鼠IgG（1:2000；Cell Signaling Technology Inc.）再孵育30分钟。使用SA3800细胞分析仪（日本东京Sony Corp.）获取荧光数据，并使用SA3800软件版本2.05（Sony Corp.）分析。

2.7 通过流式细胞术测定解离常数（K_D）

为测定K_D，将CHO/EphB4和MCF-7细胞重悬于100 μL Eb₄Mab-7-mG_2a中，浓度范围从0.001到20 μg/mL，以1:2系列稀释在封闭缓冲液中，并孵育30分钟。用0.1% BSA溶于PBS洗涤两次后，加入50 μL Alexa Fluor 488偶联抗小鼠IgG（1:200；Cell Signaling Technology Inc.），再孵育30分钟。孵育后，细胞洗涤两次并铺板到96孔板中进行测量。使用SA3800细胞分析仪获取荧光数据，并使用FlowJo软件处理。通过将结合等温线拟合到单位点结合模型，使用GraphPad Prism 6（美国加利福尼亚州拉霍亚GraphPad Software Inc.）确定K_D。

2.8 ADCC

ADCC assay按照先前发布的方法进行。简要来说，购买12只雌性BALB/c裸鼠（5周龄）自The Jackson Laboratory Inc.（日本神奈川县）。切除脾脏后，通过将脾组织通过无菌细胞筛网（目录号352360；Falcon，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）制备单细胞悬液。为消除红细胞，用冰蒸馏水裂解脾细胞30秒，随后立即用等渗缓冲液中和。剩余的脾细胞然后重悬于补充10% FBS的RPMI或DMEM中，形成效应细胞制备物。靶细胞（CHO-K1、CHO/EphB4、MCF-7或EphB4-KO MCF-7）用10 μg/mL钙黄绿素AM（Thermo Fisher Scientific Inc.）标记并重悬于相同培养基中。将靶细胞（每孔1×10?）铺板到96孔板中，与效应细胞以50:1的比例组合，并用100 μg/mL Eb₄Mab-7-mG_2a或对照PMab-231处理。在37°C孵育4.5小时后，测量上清液中释放的钙黄绿素量。使用微孔板读数仪（PowerScan HT；BioTek Instruments Inc.，美国佛蒙特州威努斯基）检测荧光强度，激发和发射波长分别为485和538 nm。使用以下公式计算裂解百分比：（靶细胞-效应细胞培养物的荧光 - 靶细胞单独的自发荧光）/（完全裂解后的最大荧光 - 自发荧光）×100。使用含0.5% Triton X-100、10 mM Tris–HCl（pH 7.4）和10 mM EDTA的缓冲液实现完全细胞裂解。所有实验进行三次重复。

2.9 CDC

CDC assay按照既定程序进行。简要来说，细胞用10 μg/mL钙黄绿素AM标记，悬浮于培养基中，并以每孔1×10?个细胞铺板到96孔板中。向孔中加入兔补体（最终稀释1:10；Low-Tox-M Rabbit Complement；加拿大安大略省霍恩比Cedarlane Laboratories）和100 μg/mL Eb₄Mab-7-mG_2a或对照PMab-231。在37°C孵育4.5小时后，测量上清液中释放的钙黄绿素，并如ADCC部分所述计算荧光强度。

2.10 体内抗肿瘤活性

所有涉及动物的程序均根据机构指南进行，并获得了微生物化学研究所动物伦理委员会的批准（日本沼津；批准号2024–071）。雌性BALB/c裸鼠（5周龄）购自The Jackson Laboratory Inc.，并在无病原体条件下维持。通过将5×10? CHO-K1、CHO/EphB4、MCF-7或EphB4-KO MCF-7细胞与Matrigel（BD Biosciences）混合注射到每只小鼠的左腹侧创建皮下异种移植瘤。然后在细胞接种后第7、14和21天腹腔内递送抗体（Eb₄Mab-7-mG_2a或对照PMab-231），每只小鼠剂量为100 μg。此后，每周两次使用卡尺测量肿瘤体积，并通过将较短直径的平方乘较长直径再除以二计算。

2.11 免疫组化分析

小鼠异种移植瘤组织的免疫组化分析如先前所述进行。简要来说，切割石蜡包埋的组织切片并安装在显微镜载玻片上。用二甲苯脱蜡并通过梯度乙醇系列再水化后，用含过氧化氢的甲醇阻断内源性过氧化物酶活性。通过将切片在0.01 M柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中煮沸10分钟进行抗原修复。然后将切片在室温下与抗Ki-67抗体（1:200稀释；克隆SP6，ab16667，英国剑桥Abcam）孵育60分钟。使用3,3′-二氨基联苯胺与ChemMate EnVision kit（美国加利福尼亚州卡平特里亚Dako）可视化免疫反应性，随后用苏木精复染。在Nikon Biophot显微镜（日本东京Nikon）下检查染色切片，并使用ECLIPSE TE2000-U显微镜（Nikon）捕获图像。使用e-Path图像分析软件（日本东京e-Path Co.）量化Ki-67阳性细胞。

2.12 统计分析

所有实验进行三次重复，数据表示为平均值±SD。在大多数图中，误差棒表示平均值±SD。在一些图中，SD仅显示在正方向，如其相应图注所述。使用双向ANOVA随后进行Tukey's或Sidak's多重比较检验或非参数Mann-Whitney U检验（如适用）进行统计分析。所有分析使用GraphPad Prism 10软件（美国加利福尼亚州拉霍亚GraphPad Software Inc.）进行。

3 结果

3.1 类转换抗EphB4单克隆抗体的开发及EphB4在乳腺癌亚型中表达的分析

为确定EphB4表达在乳腺癌中的临床相关性，首先使用来自KMplot的RNA-seq基于数据集进行Kaplan-Meier生存分析。在EphB家族成员中，高EphB4表达与乳腺癌患者的不良OS显著相关（图1A），提示EphB4的潜在致癌作用。高EphB2表达也显著，但后续分析侧重于EphB4，因其风险比略高且在乳腺癌中具有既定相关性。

我们小组先前开发的小鼠IgG₁单克隆抗体B4Mab-7特异性识别表达EphB4的肿瘤细胞。为增强其效应功能，如ADCC和CDC，将B4Mab-7类转换为小鼠IgG_2a格式，从而生成Eb₄Mab-7-mG_2a（图1B）。为检查跨细胞模型的EphB4蛋白表达，使用来自CHO-K1、CHO/EphB4、MCF-7和EphB4-KO MCF-7细胞的裂解液进行Western印迹分析。值得注意的是，我们发现Eb₄Mab-7-mG_2a触发CHO/EphB4和MCF-7细胞中EphB4表达的增加，但在CHO-K1和EphB4-KO MCF-7细胞中未触发（图1C）。此外，EphB4在代表不同亚型的多种乳腺癌细胞系中表达，包括BT-474（管腔B型）、SK-BR-3（HER2+）、MDA-MB-468（基底样）和HBC5（三阴性）。然而，在非肿瘤生成性乳腺上皮细胞系MCF10A和正常人乳腺组织裂解液中几乎检测不到EphB4（图1C）。总之，这些发现表明，相对于正常乳腺组织，EphB4在多种乳腺癌亚型中频繁过表达。这种差异表达模式得到先前临床和转录组学研究的进一步支持。Kumar等人发现EphB4在大部分人类乳腺肿瘤中高表达并作为生存因子发挥作用。Ding等人进一步证明EphB4表达在HER2阳性乳腺癌中特别升高，并与不良临床结果相关。支持其预后相关性，Brantley-Sieders等人报道高EphB4表达与乳腺癌患者的总生存期减少和复发风险增加相关。

3.2 Eb₄Mab-7-mG_2a对Ephrin-B2诱导的细胞增殖和ERK信号传导的影响

鉴于EphB4在乳腺癌中频繁过表达并与不良预后相关，我们试图确定EphB4在配体接合时是否功能性地贡献于肿瘤细胞行为。为此，我们检查了Ephrin-B2（一种已知的EphB4配体）对细胞增殖的影响。有趣的是，Ephrin-B2刺激促进了MCF-7细胞的增殖，但未促进EphB4阴性MCF10A细胞的增殖，表明由EphB4介导的配体依赖性增殖信号传导（图2A）。然而，与Eb₄Mab-7-mG_2a共处理显著抑制了MCF-7中Ephrin-B2诱导的增殖，但在MCF10A细胞中未抑制（图2B）。此外，Ephrin-B2刺激促进了MCF-7细胞中时间依赖性的ERK1/2磷酸化，该磷酸化被与Eb₄Mab-7-mG_2a共处理减弱，但未被对照PMab-231减弱（图2C）。在EphB4-KO MCF-7细胞中未观察到此类信号传导，证实EphB4特异性激活了ERK通路。这些结果表明Eb₄Mab-7-mG_2a抑制了表达EphB4的乳腺癌细胞中与增殖相关的Ephrin-B2诱导的ERK信号传导。

相反，单独用Eb₄Mab-7-mG_2a处理在3天培养期内未改变MCF10A、MCF-7或HBC5细胞的细胞增殖，提示最小的基础激动或毒性活性（图S1）。值得注意的是，尽管EphB4在代表三阴性乳腺癌亚型的HBC5细胞中显示相对高的内源性表达，在缺乏Ephrin-B2刺激的情况下未观察到生长抑制效应，进一步支持了抗体作用的特异性和配体依赖性。

3.3 Eb₄Mab-7-mG_2a和B4Mab-7对EphB4表达细胞和对照细胞的结合活性

如通过使用增加抗体浓度（0.01–10 μg/mL）的流式细胞术评估，Eb₄Mab-7-mG_2a及其亲本抗体B4Mab-7均表现出剂量依赖性结合到CHO/EphB4和MCF-7细胞（图3）。相反，两种抗体均未显示可检测的结合到EphB4阴性CHO-K1或EphB4-KO MCF-7细胞（图3）。这些结果证实了两种抗体对人EphB4的高特异性，并证明类转换为IgG_2a保留了靶标识别。

3.4 Eb₄Mab-7-mG_2a对EphB4表达细胞的结合亲和力

使用流式细胞术进行Eb₄Mab-7-mG_2a结合到EphB4表达细胞的动力学分析。如图4A,B所示，Eb₄Mab-7-mG_2a的K_D对于CHO/EphB4细胞为5.4×10^?9 M，对于内源性表达EphB4的MCF-7细胞为8.5×10^?10 M。这些结果表明Eb₄Mab-7-mG_2a对过表达和内源性